Progetto di ricerca scientifica sull’asbesto

Nell’area Giuliana, le provincie di Trieste e Gorizia con un’appendice verso il territorio della Bassa Friulana, il mesotelioma pleurico maligno, presenta attualmente un’incidenza tra le più alte in Italia e nel resto dell’Europa. La neoplasia in queste aree, già letteralmente ben descritta è dovuta in particolare all’intensa esposizione all’asbesto, almeno fino all’inizio degli anni ‘90, nei siti industriali di Trieste e Monfalcone e principalmente nei cantieri navali e nei porti delle due città.
Se in precedenza si supponeva che il mesotelioma colpiva solo i lavoratori, diversi studi hanno dimostrato che il male si può sviluppare tra i componenti del nucleo famigliare del lavoratore, o in persone che nulla hanno avuto a che fare con la manipolazione o l’esposizione diretta con l’asbesto.

Pertanto, come Sezione LILT, avendo diversi associati di famigliari deceduti a causa del micidiale minerale e, per il continuo contatto con Reparti e Uffici dedicati dall’Azienda Sanitaria a tale male, ci siamo sentiti la responsabilità e il dovere di svolgere il nostro ruolo sociale sulla prevenzione anche, aiutando la ricerca, come quella descritta qui sotto.

Il presidente della Sezione Isontina, Cav. Umberto Miniussi, dopo varie interlocuzioni con soci e personale scientifico, intende continuare in Sezione l’attività di ricerca. La proposta trova interesse a livello di LILT Nazionale, tanto che il 15 novembre 2017 ha presentato domanda di finanziamento per il Progetto di ricerca denominato “Omeostasi del ferro a livello polmonare e patologie asbesto correlate: nuovi approcci per lo screening della popolazione degli esposti” di cui la responsabile scientifica è la prof.ssa Violetta Borelli. Mentre tra i partners figurano le sezioni LILT di Trieste e di Udine.

19 aprile 2018, il progetto è ammesso a finanziamento, ottenendo un contributo di € 80.000,00, erogati da LILT secondo le seguenti modalità: 60% al momento della notifica da parte della Sezione di Gorizia; 40% all’approvazione da parte di apposita Commissione nazionale LILT della relazione finale e della relativa rendicontazione contabile.
L’amministrazione comunale di Monfalcone, giunta a conoscenza del finanziamento del suddetto progetto, ha chiesto al Presidente LILT un approfondimento sui contenuti, le modalità di svolgimento dell’attività di ricerca e le ricadute sul territorio Isontino. Il presidente Miniussi e la prof.ssa Borelli hanno presentato al Sindaco del Comune di Monfalcone, dr.ssa Anna Maria Cisint, le attività di ricerca svolte finora dalla Sezione e della collaborazione con l’Unità Operativa Anatomia Patologica dell’Azienda per l’Assistenza Sanitaria N.2 Bassa Friulana-Isontina (AAS2), su cui si basa l’attuale progetto LILT. I risultati di quella collaborazione sono stati pubblicati su: Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 2018, 81, 98-105, e hanno fornito le basi su cui è stato sviluppato il progetto della dr.ssa Borelli e della Sezione LILT.
Il Sindaco in quella sede dichiarò il suo interesse per l’attività della Sezione LILT e per quanto scientificamente presentato. Dichiarando di cofinanziare il progetto. Inoltre il Sindaco sottolineò la volontà di sostenere il lavoro condotto dall’AAS2 nella raccolta, classificazione e catalogazione di campioni di tutti i casi di patologie asbesto correlate, in continuità con l’attività svolta dal prof. Claudio Bianchi, già presidente della Sezione LILT.

Nel luglio 2018 sono state intraprese le pratiche per la stipula di una convenzione LILT-Dipartimento Scienze della Vita dell’Università di Trieste, finalizzata all’attivazione di un assegno di ricerca per attività da svolgersi nell’ambito del suddetto progetto. Dopo alcuni mesi, al momento della firma della convenzione, il Cav. Umberto Miniussi chiese di aggiungere una clausola che consentisse alla LILT di poter disporre dei risultati derivanti dalle attività dell’assegnista, potendoli divulgare liberamente, modificando perciò l’articolo 9, “Norma finale” della Convenzione LILT-DSV Università, che originariamente recitava: “I risultati, brevettabili o no, ottenuti dall’esecuzione della collaborazione – delle collaborazioni, oggetto della presente Convenzione, rimarranno di proprietà dell’Università, la quale ne potrà disporre pienamente”. Furono quindi effettuati diversi quanto inutili tentativi di dirimere la questione. A fronte della manifesta difficoltà a modificare il testo come richiesto, il Cav. Umberto Miniussi decise di non sottoscrivere la convenzione. (Tutti questi passaggi sono documentabili in base allo scambio di email tra i vari attori).

In Ottobre 2018 la Sezione LILT, dovendo iniziare la ricerca, di fronte all’urgenza di reclutare un ricercatore dedicato, decide di percorrere la via intrapresa nel 2014 da un’altra Onlus, l’AEA di Monfalcone. Il Cav. Minuissi ha quindi preso contatti con il Direttore scientifico della “Fondazione Callerio”, Prof. G. Sava, per discutere la possibilità di stipulare un accordo di collaborazione per l’attività di ricerca relativa al progetto LILT. Soluzione che trova ostacoli nel Consiglio Direttivo della Fondazione, tanto che, l’accordo svanisce. Intanto il quotidiano locale “Il Piccolo”, in data 8 novembre, pubblica un articolo in cui il Comune di Monfalcone dichiara la volontà di cofinanziare il progetto LILT con 40.000,00 euro, cui segue il 20 novembre una conferenza stampa, allo scopo di dare giusto e reale risalto alla ricerca ed alle strutture coinvolte.
Nella conferenza, tenutasi presso la sede comunale di Monfalcone, sono stati illustrati i contenuti del progetto LILT mentre il Sindaco di Monfalcone ha ribadito la disponibilità del Comune a sostenere finanziariamente la ricerca con un assegno diretto alla Sezione LILT.

A fine novembre 2018 c’è il progetto, ci sono i soldi ma, manca il ricercatore dedicato, Miniussi si trova a dover decidere e, consultati i Revisori del Conto dell’Associazione, assume con contratto a tempo determinato dal gennaio 2019 e per sei mesi il ricercatore dott. Fulvio Celsi.

Inizia così la prima parte della ricerca. Con i risultati che si stanno ottenendo viene rinnovato il contratto del ricercatore per ulteriori sei mesi e fino a dicembre 2019. Nel contempo, visto il buon andamento della ricerca viene assunta da settembre 2019, a tempo determinato per 12 mesi la ricercatrice dr.ssa Paola Zacchi.

La prima parte della ricerca, il 22 novembre 2019, viene pubblicata sulla rivista scientifica “Journal of Toxicology and Environmental Health, Part. A” dal titolo: Pleural Mesothelioma and lung cancer: the role of asbestos exposure and genetic variants in selected iron metabolism and infiammation genes. (F. Celsi, R. R. moura, M. Schnaider, F. Vita, L. Finotto, G. Zabocchi, P. Zacchi e V. Borelli)

“Ruolo di alcune varianti genetiche nello sviluppo del carcinoma polmonare e del mesotelioma in soggetti esposti all’amianto”.

In questo studio effettuato dal nostro gruppo di ricerca (Celsi et al., Plureal mesothelioma and lung cancer: The role of asbestos exposure and genetic variants in selected iron metabolism and infiammation genes; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues) è stato indagato il rapporto tra la presenza di varianti a carico di geni coinvolti nel metabolismo del ferro e la probabilità di sviluppare mesotelioma pleurico o carcinoma polmonare in individui esposti all’amianto.

Lo studio fa parte di una linea di ricerca già parzialmente indagata in precedenza, con la scoperta che alcune varianti in geni legati al metabolismo del ferro possono diminuire la probabilità di sviluppare mesotelioma in seguito all’esposizione all’amianto. Lo studio attuale amplia e conferma le conclusioni precedenti, prendendo in esame un nuovo gruppo di individui affetti da mesotelioma e includendo nell’analisi un gruppo di individui che hanno sviluppato il carcinoma polmonare.

Appare così rafforzato il ruolo di alcune varianti genetiche nel diminuire la probabilità dello sviluppo di tumori polmonari e pleurici, in particolare le mutazioni presenti sul gene HEPH, che codifica per una proteina chiamata “Efestina” legata all’assorbimento del ferro a livello intestinale.

Lo studio è stato reso possibile alla collaborazione con le strutture di Anatomia Patologica (sedi di Gorizia e Monfalcone) e di prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro dell’AAS2 “Bassa Friulana-Isontina”. Grazie all’intensa attività di indagine del prof. Claudio Bianchi e dei suoi successori presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone, è presente infatti un’importante archivio di tessuti provenienti da individui esposti all’amianto, sui quali è stato possibile effettuare l’analisi genetica.

Questo studio rappresenta un ulteriore passo avanti nel determinare il contributo delle caratteristiche genetiche individuali nell’insorgenza delle neoplasie asbesto-correlate negli ex-esposti. Individuare un’associazione tra determinate varianti genetiche e la suscettibilità individuale verso lo sviluppo di neoplasie amianto-correlate consentirebbe di programmare la sorveglianza sanitaria degli ex-esposti all’amianto secondo uno schema graduato, secondo un rapporto costi-benefici “personalizzato”, consentendo di anticipare diagnosi e trattamento al fine di migliorare la sopravvivenza e la qualità della vita dei pazienti.

Dopo la pubblicazione sulla prestigiosa rivista, in dicembre, presso la Sala Consiliare del Municipio di Monfalcone, viene presentata dalla prof.ssa Borelli e dai ricercatori la prima parte della ricerca e gli obiettivi per la seconda parte.

Secondo anno, obiettivi del progetto

Studi genetici

  • Analisi dell’esoma finalizzata ad evidenziare varianti genetiche protettive o associate ad un maggiore rischio di sviluppare neoplasie (mesotelioma pleurico maligno e carcinoma polmonare) in seguito all’esposizione all’asbesto.
  • Analisi dell’esoma finalizzata ad evidenziare varianti genetiche predittive alla risposta alla radioterapia ad alte dosi per il mesotelioma pleurico: i test genetici come strumenti della radioterapia personalizzata.

Studi funzionali: biologia molecolare e cellulare

  • Analisi immunoistochimica della distribuzione tessutale dell’efestina e analisi cellulare dei cambiamenti a carico del metabolismo del ferro indotti da mutazioni nel gene per l’efestina (heph)

Ad aprile 2020 mentre il progetto continua ad implementarsi, viene osservato con interesse da diversi Centri scientifici e Universitari in Regione e nel resto della Nazione, a seguito di interlocuzioni verbali viene stipulato un accordo tra il neo presidente della Sezione LILT dott. Michele Luise e il Direttore del Dipartimento di Scienze della Vita, prof. Mauro Tretiach, per il finanziamento all’Università degli Studi di Trieste di un posto di assegno di ricerca per il settore scientifico-disciplinare MED/04 per il programma di ricerca “Omeostasi del ferro a livello polmonare e patologie asbesto correlate: nuovi approcci per lo screening della popolazione degli esposti”.

Il responsabile LILT della ricerca, Cav. Miniussi, vede innalzarsi quanto proposto e costruito nel 2017 al momento del suo massimo incarico in Lilt. Tutto è stato possibile grazie all’aiuto concreto dell’Amministrazione Comunale di Monfalcone, di associazioni o cittadini del Territorio (Anfi Gorizia, Fam. Boscarol-Zuberti, i sig. Mariano, Vesna, Fantuzr, Violin e altri), pertanto ulteriori passi su questa ricerca possono essere ancora fatti se troveremo ancora interesse e sostegno.

Ci sono prospettive e attese da questa ricerca per salvare o perlomeno aumentare il periodo di vita di soggetti colpiti dall’asbesto. Nel contempo continuiamo ad essere critici con chi non ha mai inteso aiutare questa ricerca e i volontari impegnati nell’aiuto verso i malati di asbesto e le loro famiglie, anche perché i colpiti dalle fibre di amianto continuano ad ammalarsi e morire per colpa di un sistema industriale portato al profitto e all’interesse personale.

Il progetto continua mentre la prima è ripresa e pubblicata su una rivista scientifica a livello internazionale.

Da gennaio 2021 lo studio prosegue sull: ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA DELLA DISTRIBUZIONE TESSUTALE DELL’EFESTINA e ANALISI CELLULARE DEI CAMBIAMENTI A CARICO DEL METABOLISMO DEL FERRO INDOTTI DA MUTAZIONI NEL GENE PER L’EFESTINA (HEPH).

PREMESSA

E’ ben noto il ruolo giocato dal ferro nel danno polmonare indotto dalle fibre di asbesto. Il nostro gruppo di ricerca (nel corso del precedente progetto finanziato dal Bando di ricerca sanitaria LILT 2017) ha valutato la presenza di polimorfismi genici su 10 geni coinvolti nel metabolismo del ferro analizzando campioni di DNA estratti da tessuti autoptici di pazienti esposti all’asbesto deceduti per aver sviluppato il mesotelioma pleurico maligno o il carcinoma polmonare, e confrontandoli con quelli ottenuti da pazienti esposti ma deceduti in tarda età per patologie non-asbesto correlate. Da questa analisi genomica è emersa la presenza di una mutazione protettiva nei confronti del mesotelioma e del carcinoma polmonare presente nel gene che codifica per la proteina efestina [Crovella et al, 2016: Celsi et al, 2019].

L’efestina è una proteina appartenente alla famiglia delle ferro-ossidasi il cui accoppiamento funzionale con la proteina canale Ferroportina (anche nota come SLC40A1) permette di ridurre la concentrazione di ferro citosolica attraverso il trasporto del ferro ferroso (Fe2+) nell’ambiente extracellulare [Vashchenko & MacGillivray, 2013]. Tale trasporto viene utilizzato dagli enterociti della mucosa intestinale allo scopo di promuovere l’immissione fisiologica nel circolo sanguigno del ferro assunto attraverso l’alimentazione e sua successiva distribuzione ai diversi tessuti una volta che il ferro ferroso viene ossidato a ferro ferrico (Fe3+) e quindi caricato dalla proteina serica transferrina [Yeh et al., 2011]. A livello cellulare tale via di trasporto del ferro è vista quale meccanismo di protezione nei confronti di un eccessivo accumulo citosolico di Fe2+, catalizzatore di radicali liberi e di conseguente danno genotossico [Valko et al., 2016]. A supporto di tale ruolo protettivo della via di uscita del ferro cellulare, recentemente è stato dimostrato che l’espressione dell’efestina risulta fortemente diminuita nei tumori più aggressivi della mammella (Wang et al., 2017). La forma mutata dell’efestina da noi identificata porta alla sostituzione dell’aminoacido Acido Aspartico in posizione 571 con l’Istidina, amino acido caratterizzato dalla presenza di una catena laterale imidazolica, generalmente utilizzata per strutturare un sito di legame per metalli di transizione come il ferro ed il rame. Le conseguenze funzionali che tale mutazione comporta sono a tutt’oggi non conosciute come del resto poco caratterizzata è l’espressione dell’efestina nei diversi tessuti dell’uomo aldi fuori del tessuto intestinale. Attualmente, nell’uomo, la sua distribuzione e funzione sono note solo a livello intestinale [Vashchenko G & MacGillivray, 2013], mentre non vi sono studi attendibili riguardo alla sua distribuzione e funzione in altri tessuti ed in particolare a livello dell’apparato respiratorio. Si ritiene comunque che in questi siti la presenza di efestina sia associata ad una sorta di protezione nei confronti dello stresso ossidativo [Wang et al, 2017].

OBBIETTIVI:

Con questo studio ci proponiamo i seguenti l’obbiettivi:

1) una analisi dettagliata della distribuzione della ferrossidasi efestina nei tumori asbesto-correlati, principalmente MPM e adenocarcinoma polmonare, in rapporto al tessuto sano;

2) dipanare il meccanismo molecolare che sottende alla “protezione” nei confronti delle patologie tumorali asbesto-correlate esercitata dalla efestina mutata in posizione 571.

DISEGNO DELLO STUDIO

Obiettivo 1: analisi immunoistochimica della distribuzione tessutale della proteina efestina in diversi tessuti umani.

Nell’uomo la distribuzione e funzione dell’efestina è stata ben caratterizzata solo a livello dell’intestino. In considerazione del possibile ruolo protettivo nei confronti delle patologie asbesto-correlate di una sua variante (evidenziata dai precedenti studi genetici), in questo studio intendiamo innanzitutto caratterizzare la distribuzione dell’efestina nei tessuti implicati nell’insorgenza delle patologie asbesto-correlate (contemplate nella Lista 1 dell’INAIL): polmone, pleura, laringe e ovaio nella popolazione non esposta e non affetta da patologie asbesto-correlate, in modo da costruire una mappa di distribuzione in una popolazione di riferimento.

Successivamente intendiamo valutare eventuali variazioni nella distribuzione ed intensità di espressione di questa proteina in relazione all’esposizione all’amianto e all’insorgenza o meno di patologie asbesto correlate.

Al fine di costruire una mappa di distribuzione dell’efestina in diversi tessuti in condizioni normali e in condizioni patologiche, legate all’esposizione all’amianto, verrà effettuato uno studio sulla distribuzione di questa proteina nei diversi tessuti di due gruppi di individui deceduti nel periodo 1990-2015 e residenti nella stessa area geografica (provincia di Gorizia):

  • soggetti non esposti all’asbesto e deceduti per patologie non correlabili all’amianto (NE)
  • soggetti esposti all’asbesto, deceduti per mesotelioma pleurico maligno (MPM), carcinoma polmonare (CP), carcinoma alla laringe (CL), carcinoma ovarico (CO).

Numerosità del campione: non essendo disponibili dati relativi alla distribuzione della proteina efestina in altri distretti corporei al di fuori dell’apparato intestinale, non è al momento definibile il

numero totale dei soggetti arruolabili. Nell’ottica della definizione del corretto sample size, è pertanto prevista, al raggiungimento dell’analisi dell’espressione dell’efestina nei diversi distretti corporei in 50 campioni NE, un’analisi ad interim dei dati acquisiti. Individuata quindi la variabilità interindividuale nell’espressione della proteina, sarà possibile determinare il numero di campioni necessari per evidenziare variazioni statisticamente significative nei diversi gruppi.

Caratteristiche dei due gruppi (si veda la scheda di raccolta dati alla fine del documento):

  • Variabili demografiche.

Ogni campione appartenente ai tre gruppi sarà corredato dai seguenti dati relativi alle variabili demografiche (età al decesso, sesso) e allo stile di vita (fumatore o non fumatore). I campioni dei diversi gruppi verranno appaiati in base a queste caratteristiche.

  • Caratteristiche cliniche.

La diagnosi di MPM, CP, CL e CO è ottenuta mediante esame istologico e analisi immunoistochimica.

  • Caratteristiche espositive.

Le caratteristiche di esposizione [domestica, professionale (cantieristica, edilizia, marina ecc…), extra-lavorativa (es. hobbies) o ambientale] sono determinate sia

(1) dai dati occupazionali forniti dal Servizio di Prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro dell’Azienda sanitaria universitaria Giuliano Isontina (ASU GI), sia

(2) in base agli indicatori biologici di esposizione analizzati presso l’ASUGI (corpuscoli di asbesto polmonari) e presso l’ARPA di Milano (corpuscoli e fibre di asbesto polmonari).

La stima dell’esposizione cumulativa ad asbesto degli ex-esposti (lavoratori) attraverso l’analisi del carico polmonare degli indicatori biologici (corpuscoli e fibre di amianto) è largamente impiegata nell’ambito dei procedimenti penali in corso; inoltre consente di caratterizzare con precisione ed in modo obbiettivo l’esposizione fornendo un parametro indispensabile nella selezione dei campioni per le indagini a scopi di ricerca. Attualmente la determinazione del carico polmonare di asbesto  viene commissionata dalla Procura della Repubblica (nel corso delle proprie indagini) all’Azienda Sanitaria n.2, dove viene effettuata l’analisi di campioni di tessuto polmonare (mediante microscopio ottico) per la determinazione dei corpuscoli di asbesto secondo la metodica standardizzata recentemente messa a punto dal Gruppo Nazionale Biofibre (RAPPORTI ISTISAN 17/12 ISSN 1123-3117), con cui il responsabile della ricerca ed il personale dell’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone collaborano da anni. La determinazione delle fibre di amianto viene invece effettuata, sul materiale allestito dell’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone, presso l’ARPA di Milano (mediante microscopia elettronica a scansione, SEM) sempre nell’ambito del percorso analitico delineato dal Gruppo Nazionale Biofibre.

I dati occupazionali e quelli relativi alla caratterizzazione mineralogica polmonare degli individui deceduti per malattia professionale amianto correlata iscritti in qualità di Parti Offese per l’Art. 589 C.P, presso la Procura della Repubblica di Gorizia verranno ottenuti ed utilizzati previa richiesta di autorizzazione alla Procura.

Tutte le informazioni relative ai singoli pazienti che potrebbero consentire di identificare in maniera univoca la persona verranno conservate in un database elettronico criptato. Gli individui saranno identificati con un codice univoco progressivo e la corrispondenza di questo con le informazioni personali verrà anch’essa criptata elettronicamente in rispetto delle attuali normative relative al trattamento di dati sensibili.

Per il trattamento di questi dati a fini di ricerca, inclusi anche i risultati dell’analisi genetica, non è necessaria autorizzazione, si veda l’Autorizzazione generale al trattamento dei dati personali effettuato per scopi di ricerca scientifica (n°9/2016) del 15/12/2016, concessa dal Garante per la protezione dei dati personali.

Campioni: tessuti inclusi in paraffina disponibili quali residui delle analisi autoptiche.

Tipologie tessutali:

-tessuti sede di patologie asbesto correlate riconosciute (Helsinky criteria e Lista 1 INAIL): polmone, pleura, laringe, ovaio [tessuto sano nel gruppo NE, tessuto sano (se disponibile) e patologico negli altri gruppi];

-intestino, tessuto che funge da controllo positivo di espressione della proteina efestina, in cui la sua espressione e funzione sono state ben caratterizzate.

Analisi immunoistochimica

Da ogni blocchetto di paraffina, relativo a ciascuna tipologia tessutale, verranno ottenute sezioni seriali dello spessore di 4 µm (7 sezioni per ciascun tessuto incluso). Le prime due sezioni verranno sottoposta a colorazione con Ematossilina Eosina per verificare la qualità del preparato e caratterizzare la tipologia delle strutture presenti.

La valutazione in immunoistochimica dell’efestina verrà effettuata attraverso l’impiego di due diversi anticorpi policlonali commerciali, distribuiti da Santa Cruz Biotechnology e da Invitrogen.

Verranno valutate sia l’intensità di espressione della proteina sia la tipologia di cellule che la esprimono (stroma o infiltrato immunitario). In tal caso si prevede di eseguire un approccio di doppia marcatura efestina/marker selettivo per una determinata componente monocito-macrofagica (colorazione per CD68 e CD165).

Il software della Leica “Aperio ImageScope” verrà utilizzato per la quantificazione dell’espressione dell’efestina nei preparati sottoposti ad indagine immunoistochimica.

Analisi statistica

Al fine di ottenere una distribuzione più omogenea dei campioni, saranno selezionati quelli provenienti da pazienti deceduti in un’età compresa tra 65 e 85 anni. Inizialmente, verrà analizzata l’espressione della proteina in un gruppo di 50 pazienti, in 4 tessuti diversi. Da questa prima analisi “ad interim” potrà essere calcolata la frequenza della variabilità interindividuale e quindi successivamente la numerosità campionaria.

Obiettivo 2: analisi strutturale e funzionale della forma mutata dell’efestina (mutante D571H)

Il cDNA per l’efestina wild type (wt) e per la variante da noi identificata come protettiva nei confronti del mesotelioma pleurico (mutante D571H) verranno clonati nel vettore di espressione di lievito pIB2. Questo consentirà la produzione della proteina ricombinante in lievito Pichia Pastoris e la sua successiva purificazione.

Successivamente in collaborazione con il prof. Musci (Università degli Studi del Molise) e della prof.ssa Maria Carmela Bonaccorsi di Patti (Università La Sapienza di Roma), ci proponiamo di eseguire una caratterizzazione strutturale mediante tecniche calorimetriche; proteolisi controllata della catena polipeptidica e analisi dettagliata dello stato redox dei siti del ferro e del rame sulle varianti efestina wt e mutante D571H. Tali metodologie sono state applicate con successo dal gruppo di ricerca per l’esecuzione dell’analisi funzionale della Ceruloplasmina, un ulteriore membro della famiglia delle ferrossidasi e omologo dell’efestina.

Analisi dei cambiamenti a carico del metabolismo del ferro indotti da mutazioni nel gene per l’efestina (Heph).

A questo scopo verranno utilizzate due linee cellulari per simulare il tessuto polmonare: le A549, una linea di adenocarcinoma di cellule alveolari basali e le MeT5A, una linea di mesotelio immortalizzata. In queste due linee cellulari sarà over-espressa, in modo transiente, la proteina Heph, sia in forma wild-type che in forma mutata. All’inizio verrà verificato che la proteina wild-type over-espressa non sia tossica per le cellule, controllando la vitalità cellulare con il saggio MTT.

Lo stesso test verrà ripetuto con la proteina mutata; questo saggio serve anche per ottimizzare le condizioni di trasfezione.  Sulle cellule transfettate si procederà anche a valutare la localizzazione intracellulare della proteina, che in fase di clonaggio verrà provvista di un tag FLAG, ovvero di una breve sequenza amminoacidica che permette di distinguere la proteina over-espressa rispetto a quella endogena attraverso l’utilizzo di un anticorpo commerciale ad alta affinità diretto contro il tag.

Per la caratterizzazione della distribuzione intracellulare si procederà con l’allestimento di immunofluorescenze doppie con anticorpi selettivi per i diversi compartimenti intracellulari (es. EEA1 marker endosomiale, Lamp1 marker lisosomiale, TGN38 marker dell’apparato di Golgi, rab11 marker dell’endosoma coinvolto nel reciclaggio dei recettori). La frazione di efestina presente sulla membrana plasmatica, ovvero quella funzionale per il trasporto del ferro dal citosol all’ambiente extracellulare, verrà invece determinata in maniera quantitativa attraverso saggi di biotinilazione di superficie, che prevedono l’utilizzo di una biotina chimicamente modificata e resa incapace di passare attraverso il doppio strato lipidico. Successivamente, nelle due linee cellulari trasfettate transientemente con Heph wild-type o mutata, verrà valutato lo stato di ossidazione del ferro [misurando la quantita di ione ferroso (Fe2+) o ferrico (Fe3+)] utilizzando saggi colorimetrici. Questa serie iniziale di esperimenti determinerà gli effetti nel metabolismo cellulare di una variazione di attività della Heph. Se il saggio MTT avrà messo in evidenza un’aumentata tossicità della Heph mutata, questo dato sarà ulteriormente perfezionato utilizzando il test dell’annessina/propidio per determinare se la morte cellulare e di tipo apoptotico. Questi esperimenti verranno ripetuti in presenza di diverse fibre di amianto (crisotilo, amosite, crocidolite, antofillite) caratterizzate da un diverso contenuto di ferro, allo scopo specifico di analizzare il ruolo di questo elemento in presenza di Heph mutata. In particolare si determinerà se le diverse forme di amianto giocano un ruolo importante nel cambiamento del metabolismo cellulare indotto da Heph mutata. In correlazione con questi esperimenti, il ruolo delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) verrà esaminato; i ROS possono essere generati da Fe2+ attraverso reazioni di Fenton o simili, quindi, in caso di sovraccarico di ione ferroso, e ipotizzabile un aumento di ROS. Attraverso l’uso di specifici coloranti, come la 2′,7′-dichlorodiidrofluoresceina o il diidroetidio, e possibile quantificare l’aumento di ROS indotti da sovraccarico di ferro. Questi esperimenti permetteranno dunque di correlare l’aumento di ROS con l’accumulo di ioni ferroso e ferrico, dando la possibilità di verificare l’ipotesi patogenetica (presenza di Heph mutata con o senza fibre di asbesto → accumulo ioni Fe2+ e Fe3+ → aumento ROS → morte apoptotica). Al fine di migliorare la comprensione dei meccanismi patogenetici coinvolti, nelle due linee cellulari esprimenti transientemente la proteina Heph (wild-type o mutata) verrà valutata la presenza di marcatori dell’infiammazione, specificamente interleuchina 1-b, TNF-a e IL-6, dopo esposizione ai diversi tipi di fibre di amianto. Un aumento di ROS può infatti determinare un aumento dei mediatori infiammatori, causando uno stato cronico di infiammazione, risultante in un aumentato danno tissutale. Inoltre, considerando il ruolo fondamentali dei mitocondri nel rendere il Fe biodisponibili attraverso i centri Fe-S presenti nella catena respiratoria e l’attività di produzione di ROS propria del metabolismo mitocondriale, verrà esaminata la morfologia e la distribuzione di questi organelli, attraverso tecniche di microscopia confocale.

RISULTATI ATTESI E TRASFERIBILITÀ SOCIALE 

  • Obiettivo 1: attualmente, nell’uomo non è chiara la distribuzione dell’efestina a livello polmonare e degli altri tessuti sede di patologie asbesto-correlate, né se la sua concentrazione all’interno di questi tessuti possa avere un impatto sul metabolismo del ferro e sulla crescita tumorale. Con questo studio intendiamo costruire una mappa di distribuzione dell’efestina in diversi tessuti in condizioni normali ed evidenziare eventuali variazioni di distribuzione (tessutale e all’interno del tessuto: stroma vs infiltrato) ed espressione di questa proteina in seguito all’esposizione all’asbesto e allo sviluppo di patologie asbesto correlate.
  • Obiettivo 2: L’individuazione e la caratterizzazione del ruolo funzionale della variante genetica dell’efestina, da noi recentemente associato alla protezione nei confronti del MPM, potrebbe inoltre permettere il concepimento di un nuovo approccio terapeutico di prevenzione negli individui ex-esposti, basato sull’impiego di chelanti del ferro e antiossidanti, come recentemente proposto da alcuni studi preclinici [Nagai et al, 2013; Toyokuni, 2011, 2014]. la popolazione degli ex-esposti all’amianto è particolarmente numerosa nella nostra regione (più di 7000 individui-aggiornare) e l’individuazione dei fattori di rischio individuali risulta particolarmente urgente in vista del raggiungimento del picco dell’incidenza di casi del mesotelioma maligno previsto nel 2025. Lo scarso successo terapeutico nei confronti di questa neoplasia fa infatti dell’identificazione dei fattori di rischio individuali e quindi della diagnosi precoce una pressante priorità.
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    Il 22 dicembre 2021 è stato pubblicato sulla rivista scientifica “Frontiers in Oncology” la seconda parte della ricerca iniziata a gennaio 2019 “OMEOSTASI DEL FERRO A LIVELLO POLMONARE E PATOLOGIE ASBESTO CORRELATE: NUOVI APPROCCI PER LO SCREENING DELLA POPOLAZIONE DEGLI ESPOSTI” Di seguito il testo pubblicato.
    Sergio Crovella 1, Alberto Revelant 2, Elena Muraro 3, Ronald Rodrigues Moura 4, Lucas Brandão 4, Marco Trovò 5, Agostino Steffan 3, Paola Zacchi 6, Giuliano Zabucchi 6, Emilio Minatel 2 e Violetta Borelli 6*
    • 1 Dipartimento di Scienze Biologiche e Ambientali, College of Arts and Sciences, University of Qatar, Doha, Qatar
    • 2 Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (CRO) Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS), Aviano, Italia
    • 3 Unità di Immunopatologia e Biomarcatori, Dipartimento di Ricerca Traslazionale, Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (CRO) Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico, Aviano, Italia
    • 4 Dipartimento di Diagnostica Avanzata, Istituto per la Salute Materno-Infantile – Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia
    • 5 Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Ospedale Accademico di Udine, Udine, Italia
    • 6 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste, Trieste, Italia
    La radioterapia emitoracica radicale (RHR), dopo la chirurgia lung-sparing, è diventata recentemente una concreta opzione terapeutica per il mesotelioma pleurico maligno (MPM), un tumore correlato all’amianto, altamente aggressivo con incidenza crescente e prognosi infausta. Sebbene la tossicità associata a questo trattamento sia stata ridotta, non è ancora trascurabile e deve essere considerata nel trattamento dei pazienti. I fattori genetici sembrano svolgere un ruolo nel determinare la tossicità della radioterapia. Lo scopo di questo studio è l’identificazione di percorsi biologici, recuperati attraverso il sequenziamento dell’intero esoma (WES), possibilmente associati allo sviluppo di effetti avversi polmonari nei pazienti MPM trattati con RHR. Lo studio ha incluso individui con MPM, trattati con chirurgia lung-sparing e chemioterapia, seguiti da RHR con intento curativo, e seguito prospetticamente per lo sviluppo di tossicità polmonare. A causa del forte impatto delle tossicità polmonari di grado 3 sulla qualità della vita, rispetto agli eventi avversi meno gravi, per le analisi genetiche, i pazienti sono stati divisi in un gruppo di tossicità polmonare assente o tollerabile (NoSTox) (grado ≤2) e un gruppo di tossicità polmonare grave gruppo di tossicità (STox) (grado = 3). L’analisi dell’arricchimento delle varianti ha permesso di identificare diverse firme di percorso che caratterizzano i pazienti NoSTox e Stox, consentendo di formulare ipotesi sulla protezione dagli effetti collaterali derivati dalla radioterapia nonché dai fattori che predispongono a una peggiore risposta al trattamento. I nostri risultati, consapevoli dell’esiguo numero di pazienti analizzati, potrebbero essere considerati un punto di partenza per la definizione di un panel di percorsi, eventualmente utili nella gestione dei pazienti MPM.
    1. Introduzione
    Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore correlato all’amianto, altamente aggressivo, derivato dalle cellule della pleura, con un’incidenza crescente (picco previsto nel periodo 2020-2024) ( 1 ) e prognosi infausta. Tale triste esito deriva anche dalla complessa gestione della malattia, dato che la comunità scientifica dibatte ancora sul miglior protocollo da seguire in base alle tre opzioni terapeutiche attualmente disponibili: chirurgia, radioterapia e chemioterapia ( 2 – 4 ).
    Fino a poco tempo, si pensava che l’efficacia della somministrazione di routine della radioterapia nei pazienti con MPM non fosse supportata da prove ( 5 ). Negli ultimi anni, le moderne tecniche di radiazione sono state applicate dopo l’intervento chirurgico, consentendo un risparmio più efficace del tessuto normale, consentendo così dosi di radiazioni più elevate nel sito del tumore. Reasearchers dal National Cancer Institute di Aviano hanno pubblicato una serie di studi prospettici ( 6 – 8 ) che dimostra la radioterapia ad intensità modulata radicale, dopo l’intervento chirurgico al polmone-risparmiatori, porta ad un eccellente controllo loco-regionale e la sopravvivenza nei pazienti MPM. Una sopravvivenza globale (OS) mediana di 25,6 mesi e un tasso di OS a 2 anni del 58% sono tra i migliori risultati osservati in studi recenti ( 9 –11 ), sostenendo l’idea che questo approccio rappresenti una concreta opzione terapeutica per il MPM.
    Sebbene la tossicità associata a questi trattamenti sia stata drasticamente ridotta, non è ancora trascurabile e deve essere presa in considerazione quando si trattano i pazienti ( 12 ). Le tossicità polmonari sono molto comuni tra i pazienti affetti da mesotelioma sottoposti a radioterapia sull’intero emitorace anche se il trattamento è ben tollerato.
    Sebbene rari, si possono osservare effetti avversi peggiori, come la fibrosi di grado 2 o 3 e l’embolia polmonare, e la gestione di queste tossicità è ancora difficile.
    Migliori modi di prevedere, prima del trattamento, il rischio di sviluppo di effetti polmonari avversi dopo la radioterapia possono portare a trattamenti personalizzati più promettenti e a una ridotta incidenza e gravità degli effetti tardivi. C’è un crescente riconoscimento che la causa della normale tossicità dei tessuti è multifattoriale e include fattori genetici oltre a parametri dosimetrici, età del paziente, storia di fumo, trattamenti concomitanti e comorbidità ( 13 – 15 ).
    Nell’ultimo decennio sono stati pubblicati più di cento articoli che affrontano possibili associazioni tra varianti genetiche germinali e rischio di normale tossicità tissutale dopo radioterapia. Con poche eccezioni, tuttavia, questi si basavano su relativamente pochi studi che utilizzavano un approccio genetico candidato [analisi della variante a singolo nucleotide (SNV)] ( 16 ), e i risultati dell’associazione non sono stati replicati ( 17 , 18 ).
    Recentemente, le analisi di associazione genome-wide (GWAS), inclusa la meta-analisi, eseguite dal Consorzio Radiogenomics (RgC; epi.grants.cancer.gov/radiogenomics/) hanno identificato diversi nuovi SNV all’interno di geni non precedentemente collegati alla tossicità della radioterapia, in pazienti affetti da diversi tipi di cancro, come seno, prostata e polmone ( 19 , 20). Tuttavia, la suscettibilità genetica alla radiotossicità negli individui non sindromici resta da chiarire. Con l’obiettivo di contribuire all’identificazione di un possibile ruolo delle variazioni genetiche nelle vie biologiche coinvolte nella risposta alla radioterapia nei pazienti con MPM, abbiamo eseguito il sequenziamento dell’intero esoma (WES), abbinato a un nuovo approccio bioinformatico, concentrandoci non solo sugli SNV ma soprattutto su potenziali vie biologiche associate alla tossicità polmonare dopo radioterapia che possono aiutare a chiarire meglio i fenotipi osservati.
    2 metodi
    2.1 Partecipanti allo studio
    Lo studio ha incluso individui con MPM, trattati con trattamento chirurgico non radicale, come pleurectomia/decorticazione parziale (P/D) o solo biopsia e chemioterapia a base di platino più pemetrexed per MPM, seguita da radioterapia ad alte dosi con intento curativo e seguito prospetticamente per lo sviluppo di tossicità (polmonare). Altri criteri di inclusione erano età ≥18 anni, malattia residua evidente dopo l’intervento chirurgico, stadi I-IVA (secondo lo stadio TNM 7a edizione), punteggi dello stato di performance dell’Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 0-2, funzione polmonare di almeno il 50% della prevista fattibilità tecnica per l’erogazione della radioterapia emitoracica radicale (RHR), funzione del midollo osseo soddisfacente (globuli bianchi ≥2.000/μl, piastrine ≥100.000/μl, emoglobina >10 g/dl). I criteri di esclusione erano linfonodi mediastinici controlaterali patologici (N3), MPM metastatico (stadio IVB) o malattia intra-scissurale. L’istologia del tumore è stata classificata come epitelioide e non epitelioide (sarcomatoide e bifasico). Tutti i pazienti sono stati stadiati mediante tomografia computerizzata (TC) con mezzo di contrasto polmonare e addominale e tomografia a emissione di positroni (PET)/TC con 18F-fluorodesossiglucosio (18FDG).
    Tra agosto 2014 e maggio 2018, sono stati inclusi in questo studio 49 pazienti che hanno ricevuto RHR. I pazienti sono stati trattati con IMRT elicoidale, erogando la dose con Accuray Tomotherapy System. La tecnica di radioterapia è stata precedentemente descritta in dettaglio ( 7 , 8 , 11 ). I pazienti hanno ricevuto 50 Gy in 25 frazioni (tranne un caso, descritto in seguito), più un eventuale boost a 60 Gy sulle aree PET-positive.
    La OS è stata definita come il tempo (anni) di rapporti dalla randomizzazione alla morte per qualsiasi causa, o l’ultimo follow-up (fino al 1 dicembre 2020), e stimato con il metodo Kaplan-Meier, il p- value è stato calcolato con Log-rank test.
    Questo studio prospettico è stato condotto secondo i principi etici della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico locale ( Comitato Etico Indipendente del CRO di Aviano , CRO-2013-38) ed è stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i pazienti. Il servizio CRO-biobanking ha gestito e conservato tutti i campioni biologici prima dell’uso per il presente progetto (autorizzazione per le analisi ottenuta tramite protocollo numero 6825/D).
    2.2 Valutazione della tossicità della radioterapia
    La tossicità è stata valutata utilizzando i Common Terminology Criteria for Adverse Events versione 3.0 e suddivisa in tossicità precoce (durante il trattamento), tossicità acuta (1-6 mesi dalla fine della RHR) e tossicità tardiva (> 6 mesi dalla fine della RHR).
    La tossicità precoce è stata valutata settimanalmente durante le radiazioni. Dopo il completamento del trattamento con radiazioni, i pazienti sono stati esaminati a 1, 3, 6 (tossicità acuta), 8 e 12 mesi nel primo anno (tossicità tardiva) e ogni 4 mesi dall’inizio del secondo anno o prima per necessità cliniche. Sono stati analizzati tutti gli esiti di tossicità respiratoria: tosse, dispnea, fibrosi, polmonite ed eventi tromboembolici polmonari.
    2.3 Genotipizzazione, controllo qualità e imputazione/analisi statistica
    2.3.1 Estrazione del DNA
    Il DNA germinale del sangue intero (campioni di sangue raccolti in anticoagulante-citrato-destrosio prima dell’inizio del trattamento con radiazioni) è stato estratto da pazienti utilizzando il kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Milano, Italia) seguendo il protocollo del produttore. La qualità e la quantità del DNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio (2%) e utilizzando il test Invitrogen Qubit (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia). Tutti i campioni ( N = 49) estratti hanno superato con successo il controllo di qualità, basato sui requisiti Macrogen ( https://dna.macrogen-europe.com/eng/ ) per il sequenziamento dell’esoma.
    2.3.2 Sequenziamento dell’esoma
    Il sequenziamento dell’esoma è stato eseguito in outsourcing utilizzando il servizio fornito da Macrogen Europe (Amsterdam, Paesi Bassi). In breve, l’analisi sequenziamento, che mira a 150 × di copertura, ha utilizzato l’Illumina ® preparazione e sequenziamento reazione SureSelect V7 umana Kit biblioteca, in un Illumina ® HiSeq 2500 sistema, generando coppia-end legge di 125 coppie di basi.
    Gli adattatori universali Illumina sono stati rimossi utilizzando Trim Galore 0.6.1 ( http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ ). Anche le letture con lunghezza inferiore a 15 paia di basi e con punteggio Phred basso ( Q < 20) sono state rimosse utilizzando lo stesso software. Il controllo di qualità prima e dopo queste procedure è stato valutato da fastQC ( https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ ). Dopo il controllo qualità, il file FASTQ con le letture grezze è stato allineato utilizzando il pacchetto software Burrows-Wheeler Aligner ( 21 ), in particolare lo strumento bwa-mem, rispetto alla versione 38 del genoma umano di riferimento (GRCh.38). Abbiamo quindi utilizzato gli strumenti Picard ( https://broadinstitute.github.io/picard/ ) per contrassegnare i duplicati e GATK V. 4.1.2.0 ( https://software.broadinstitute.org/gatk/ ) per la ricalibrazione di base. Strelka2 è stato utilizzato per la determinazione delle varianti, quando il software è stato impiegato nella modalità di analisi dell'esoma ( 22 ). Infine, abbiamo usato di nuovo GATK per l'esclusione delle varianti di bassa qualità. L'annotazione delle varianti è stata eseguita utilizzando il software ANNOVAR ( 23 ) con database relativi al genoma di riferimento GRCh.38 (refGene, cytoBand, wgRna, 1000g_2015_aug_all, gnomad30_genome, dbscsnv11, dbnsfp35a, clinvar_20200316 e avsnp151). R Software ( 24 ) è stato impiegato per manipolare i risultati di ANNOVAR per un'analisi descrittiva e inferenziale. Abbiamo diviso l'analisi in due parti principali: individuale, che consiste nel riassumere i dati descrittivi per ogni campione sequenziato; e dati di gruppo, che mirano a confrontare i pazienti con tossicità grave rispetto a nessuna tossicità grave. L'analisi delle componenti principali (PCA) della distribuzione delle varianti è stata eseguita utilizzando i pacchetti stats R in un approccio non centrato e ridimensionata per avere una varianza unitaria prima dell'analisi ( 25 ). Inoltre, sia per le categorie individuali che di gruppo, abbiamo eseguito una "analisi di arricchimento variante" (VEA). VEA funziona in modo simile all'analisi dell'arricchimento genico per i dati di espressione: abbiamo studiato se c'erano differenze statistiche tra il numero di varianti in un percorso rispetto a un set di dati di riferimento. Abbiamo utilizzato il pacchetto R "ReactomePA" per ottenere informazioni sul percorso su ciascuno dei geni contenenti almeno una variante nel singolo set di dati ( 26 ). Quindi, abbiamo ottenuto i dati delle varianti da GnomAD Exome 3.0 ( 27 ) da utilizzare come set di dati di riferimento. È importante ricordare che, poiché la presenza di alcune varianti può essere correlata a popolazioni specifiche, abbiamo considerato per questo set di dati solo le informazioni sulle varianti europee non finlandesi (nfe). Una volta ottenuto il numero di varianti per percorso nel singolo set di dati e nel set di dati di riferimento, abbiamo utilizzato il test esatto di Fisher con tasso di falsa scoperta (FDR) per identificare le differenze statistiche nel numero di varianti. I valori di p aggiustati <0,05 sono stati considerati significativi in questa analisi. Per i dati di gruppo, abbiamo utilizzato i diagrammi di Venn per riassumere i percorsi "arricchiti" esclusivi per ciascun gruppo. 3. Risultati 3.1 Pazienti Le caratteristiche dei pazienti sono riassunte nella Tabella 1 . Un totale di 48 pazienti ha completato il trattamento come prescritto. Un paziente, che ha richiesto un'interruzione del trattamento a causa di anemia e trombocitopenia, ha ricevuto globalmente 32 Gy in 16 frazioni. Un paziente ha sviluppato una polmonite infettiva indipendentemente dalla RT e ha interrotto il trattamento, completando il corso prescritto in un secondo momento. Quarantacinque pazienti hanno ricevuto la spinta simultanea. TABELLA 1 Tabella 1 Pazienti e caratteristiche del tumore. Gli effetti avversi riportati sono riassunti nella Tabella 2 , suddivisi in eventi osservati durante il trattamento (tossicità precoce), tra 1 e 6 mesi dopo la fine della RT (tossicità acuta) e dopo 6 mesi di follow-up (tossicità tardiva), e classificati come tossicità non polmonare o polmonare. TABELLA 2 Tabella 2 Eventi non polmonari e polmonari osservati come tossicità precoce, acuta e tardiva. A livello globale, per le tossicità acute e tardive, il numero di eventi nel gruppo della tossicità non polmonare tendeva a diminuire, ad eccezione dell'aumento della gamma-glutamiltransferasi (GGT) epatico, comunemente osservato nei pazienti trattati nell'emitorace destro (non mostrato). Fratture e versamenti pericardici sono tipicamente eventi tardivi e sono stati osservati in un piccolo numero di pazienti, rispettivamente 2 e 3 casi. Al contrario, gli eventi di tossicità polmonare tendevano a svilupparsi dopo il trattamento ea durare nel tempo. Un terzo dei pazienti ha sviluppato tosse di basso grado entro 6 mesi dalla RT o in un successivo follow-up. La dispnea è stata segnalata nel 37% dei pazienti come tossicità acuta, principalmente di basso grado, ma è diventata una tossicità grave nell'8% dei pazienti, come evento tardivo. La fibrosi si è sviluppata in 3 pazienti (2 gravi) e la polmonite in 7 casi, di cui 4 di grado 3. Infine, A causa dell'impatto delle tossicità polmonari di grado 3 sulla qualità della vita, per ulteriori analisi genetiche i pazienti sono stati divisi in due gruppi: nessuna tossicità severa (NoSTox), nessuna o tossicità tollerabile (grado da 0 a 2) (grado ≤2) ( N = 40) e graveTox (STox) (grado = 3) ( N = 9) in base allo sviluppo di almeno uno tra i seguenti: tosse, dispnea, fibrosi, polmonite e/o evento tromboembolico. Le caratteristiche dei pazienti con STox e gli effetti avversi riportati sono riassunti nella Tabella 3 . Durante il trattamento non sono state registrate tossicità di grado 4 o 5. TABELLA 3 Tabella 3 STox: caratteristiche del paziente, del tumore e delle tossicità polmonari. Tra i 49 pazienti inclusi, l'OS mediana era di 25 mesi e il tasso di OS a 2 anni era del 51,4%. Non sono state osservate differenze significative di sopravvivenza tra il gruppo NoSTox e il gruppo STox (dati non mostrati). 3.2 Analisi genetica mediante analisi di arricchimento delle varianti I risultati dell'analisi genetica globale e tutti i rapporti dettagliati sull'esoma sono mostrati nei Dati supplementari 1, 2 . I Dati Supplementari 1 contengono le informazioni descrittive sull'analisi esomica dei 49 pazienti con MPM; la distribuzione delle varianti ( Tabella supplementare S1A ), la distribuzione (%) della posizione della variante ( Figura supplementare S1A ), la funzione ( Figura supplementare S1B ) e la distribuzione dei geni portatori di varianti ( Tabella supplementare S1B ) sono riportate nel rapporto sull'esoma di entrambi i gruppi (STox e NoSTox). Dati supplementari 2contenere una descrizione comparativa sui geni e sulle varianti comuni di 49 pazienti con MPM; Le varianti comuni NoSTox e STox sono state filtrate per recuperare solo le varianti comuni FunctVar ( Tabella supplementare S2A ) e ImpactVar ( Tabella supplementare S2B ) esclusive del gruppo STox; allo stesso modo, le varianti comuni NoSTox e STox sono state filtrate per recuperare le varianti comuni FunctVar ( Supplementary Table S2C ) e ImpactVar ( Supplementary Table S2D ) presenti solo nel gruppo NoSTox. Degno di nota, nessuno dei geni segnalati da Hylebos e colleghi ( 28 ), per mostrare alterazioni molecolari in MPM, era correlato allo sviluppo di tossicità polmonare nei soggetti coinvolti in questo studio (dati non mostrati). Sulla base dei risultati ottenuti considerando le varianti presenti solo nei pazienti STox, abbiamo recuperato i percorsi eventualmente interrotti dalle varianti genetiche identificate, senza, tuttavia, rilevare una firma di percorso specifica associata ai fenotipi clinici osservati (dati non mostrati). Inoltre, con l'obiettivo di applicare un approccio più ampio per arricchire l'analisi del percorso, abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento variante basata su varianti funzionali e di impatto; 47 percorsi hanno mostrato un numero significativamente aumentato di varianti funzionali esclusivamente nel gruppo NoSTox ( Tabella 4 ). Per il gruppo STox, abbiamo osservato quattro vie esclusive ( Tabella 5 ). Per quanto riguarda le varianti di impatto, abbiamo osservato 19 e 3 percorsi esclusivi per i gruppi NoSTox e STox, rispettivamente ( Tabelle 6 , 7 ). TABELLA 4 Tabella 4 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale nel gruppo NoSTox. TABELLA 5 Tabella 5 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale nel gruppo STox. TABELLA 6 Tabella 6 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante di impatto nel gruppo NoSTox. TABELLA 7 Tabella 7 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante di impatto nel gruppo STox. Tracciando le varianti eventualmente coinvolte in quei percorsi, abbiamo notato 243 varianti funzionali (lungo 64 geni), per il gruppo NoSTox e 9 varianti per STox (in 5 geni) ( Dati supplementari 3 : Tabella S3A, B ). Considerando i percorsi con varianti di impatto, abbiamo identificato 2.908 varianti (in 645 geni) presenti nei percorsi esclusivi del gruppo NoSTox, mentre è stata osservata solo una variante (un gene) nei percorsi del gruppo STox ( Dati Supplementari 3 : Tabelle S3C, D ). Nonostante le differenze genetiche e il numero di diverse varianti riscontrate tra NoSTox e STox, l'analisi delle componenti principali (PCA) ha mostrato una distribuzione omogenea delle varianti in entrambi i gruppi. Pertanto, non è stata osservata alcuna firma genetica specifica in NoSTox e STox ( Figura supplementare S3 ). Tuttavia, in tutte le analisi, il paziente 53 ha mostrato una distanza genetica significativa significativa rispetto a tutti gli altri pazienti indipendentemente dal fatto che fossero NoSTox o STox, suggerendo la presenza di una specifica firma genetica, ma non influenzando la risposta alla radioterapia. 3.2.1 Analisi dell'arricchimento della variante NoSTox L'analisi dell'arricchimento della variante ci ha permesso di identificare i percorsi nel gruppo NoSTox principalmente coinvolti in processi biologici comuni e non specifici come l'elaborazione dell'RNA, la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare e la sintesi dei lipidi. All'interno delle vie individuate, quattro di esse, legate a processi infiammatori e fibrotici, eventualmente coinvolti nello sviluppo di tossicità polmonare, sono state riscontrate anche come in silico distrutte sulla base di varianti funzionali o di impatto non presentate (o rare) in GNOMAD 2.2.1 Non -Database della popolazione finlandese (contrassegnato in grigio nelle tabelle 4 , 6 ed elencato nella tabella 8 ). 1) La prima è la via di segnalazione NFkappaB indotta da TNFR1 (R-HSA-5357956). Una variante funzionale in questo percorso è stata trovata nel paziente n. 74: un inserimento frameshift nel gene dell'ubiquitina C (UBC) (ENTREZID: 7316; esone 2: c.2051dupG o p.V685Cfs*7; senza ID rs; situato su chr12 a 124911720 posizione) in eterozigosi. 2) La seconda è la via dell'inflammasoma AIM2 (R-HSA-844615). Una singola variante funzionale correlata a questa via è stata osservata nel paziente #16: una delezione frameshift nel gene Absent in melanoma 2 (AIM2) (ENTREZID: 9447; esone 5: c.712delA o p.T238Hfs*14; senza rs ID; situato su chr1 in posizione 159062697) ( Tabella 8 ). In particolare, questa via è stata trovata anche nell'elenco delle vie del reattore da impatto in un paziente diverso che non ha sviluppato gravi tossicità polmonari (#84, Tabella 6 ). In questo caso, il paziente #84 portava una variante sull'esone2 (c.C278G) di PYD e CARD Domain Containing (PYCARD) (ID ENTREZ: 29108; variante senza ID rs situata su chr 16 alla posizione 31202200). 3) La terza via identificata come compromessa nel gruppo NoSTox, è la via a cascata del segnale del recettore dell'insulina (R-HSA-74751). Tre varianti funzionali frameshift e una stopgain sono state trovate nei pazienti n. 21, n. 39, n. 43 e n. 16, rispettivamente (Tabella 8). Tutte le varianti frameshift erano nel gene della proteina chinasi 3 attivata dal mitogeno (MAPK3) (ENTREZ ID: 5595). I pazienti #39 e #43 portavano la variante sull'esone1 c.37_38insC (senza ID rs, localizzato su chr16 in posizione 30123172). Il paziente n. 21 portava una variante dell'esone 1 c.38_39insC (senza ID rs; localizzato su chr16 in posizione 30123171). La variante di ripiego del paziente n. 16 era localizzata sull'esone 1 del gene della fosfodiesterasi 3B (PDE3B) (ENTREZ ID: 5140; esone 1 c.C447A; senza ID rs; localizzato chr11 in posizione 14644522). 4) L'ultima via che si prevede sia compromessa nel gruppo NoSTox è correlata alla biosintesi del plasmalogeno (R-HSA-75896), nei pazienti #50, #66 e #88 ( Tabella 8 ). Il gene gliceronefosfato O-Aciltransferasi (GNPAT) (ENTREZ ID: 8443) ha mostrato variazioni di impatto nei pazienti #50 e #66, rs11122266 e rs767514222, rispettivamente, entrambi nell'esone 9. Il paziente #88 portava l'SNP rs764286061 nell'alchilglicerone fosfato sintasi ( AGPS) (ENTREZ ID: 8540). TABELLA 8 Tabella 8 Elenco delle vie del reattore selezionate recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale e di impatto nei gruppi NoSTox e STox: pazienti, geni e caratteristiche delle varianti coinvolte. 3.2.2 Analisi dell'arricchimento della variante STox Per quanto riguarda l'analisi dell'arricchimento della variante STox, due percorsi, identificati in silico , hanno raggiunto il potenziale per tradurre il fenotipo di tossicità grave (contrassegnati in grigio nelle tabelle 5 , 7 ed elencati nella tabella 8 ). 1) Dissoluzione della via del coagulo di fibrina (R-HSA-75205). Una singola variazione di ripiego sul gene F membro 2 della famiglia della serpina (SERPINF2) (rs374446894), è stata portata dal paziente n. 2, che ha sviluppato un evento tromboembolico polmonare ( Tabella 5 ). 2) Formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR (R-HSA-77042). Il paziente n. ad un alto grado di fibrosi ( Tabella 7 ). Questa variante partecipa anche all'editing dell'mRNA: conversione da A a I (R-HSA-75064) e vie di deaminazione C6 dell'adenosina (R-HSA-75102); tutti insieme, questi tre percorsi sono correlati all'editing dell'mRNA. Infine, abbiamo cercato nel nostro dataset sperimentale WES tutte le varianti genetiche, ottenute tramite GWAS, precedentemente identificate come associate alla tossicità della radioterapia; non sono state rilevate precedenti varianti genetiche associate ai fenotipi studiati nell'intero esoma di individui NoTox e STox ( Dati Supplementari 4 ). 4. Discussione L'impiego di RHR in MPM ha dimostrato di conferire un vantaggio in termini di sopravvivenza, ma è associato a un profilo di tossicità non trascurabile in una frazione di pazienti ( 8 , 11 ). Questo trattamento dovrebbe essere offerto alla maggior parte dei pazienti affetti da mesotelioma in quanto aumenta la sopravvivenza a 2 anni nei pazienti inoperabili al 58%, rispetto al tasso del 28% raggiunto da coloro che ricevono solo TC o radioterapia palliativa ( 11 ). Tuttavia, le tossicità associate al trattamento possono avere un impatto rilevante sulla qualità della vita. La tossicità polmonare può influenzare pesantemente la qualità della vita del paziente, causando principalmente tosse e dispnea che perdurano nel tempo. Nella dispnea di grado 1-2, c'è un peggioramento graduale come la dispnea da sforzo, mentre la tossicità di grado 3 ha un impatto anche sulle attività della vita quotidiana. Allo stesso modo, la polmonite di grado 1-2 è spesso paucisintomatica e influisce solo leggermente sulla qualità della vita, mentre la polmonite di grado 3 può avere un impatto permanente se evolve in fibrosi grave ( 29 ), come osservato in pochi casi nel presente studio. Gli eventi molecolari che portano alla tossicità/lesione tissutale indotta dalle radiazioni sono complessi e abbracciano una varietà di processi biologici, tra cui lo stress ossidativo, l'apoptosi, l'infiammazione e il rilascio di citochine proinfiammatorie e profibrogene ( 30 ). L'ambiente infiammatorio indotto dalla RT, aggravato da polmonite e successiva eventuale fibrosi, potrebbe indurre lo sviluppo di coaguli di fibrina, potenzialmente portando a un evento tromboembolico ( 31 ), una complicanza che si è verificata in 3 dei nostri pazienti, come effetto tossico acuto e tardivo. La causa della tossicità dei tessuti normali indotta dalle radiazioni è multifattoriale ( 13 – 15 ) e si è ipotizzato che fattori genetici svolgano un ruolo nel determinare la risposta alle radiazioni ( 32 ). Nonostante i progressi delle analisi genetiche basate sulle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, sebbene alcuni GWAS e il sequenziamento clinico di pazienti affetti da cancro abbiano suggerito che un certo numero di varianti nei geni di riparazione del DNA potrebbero essere alla base delle differenze individuali nella radiosensibilità cromosomica all'interno delle popolazioni umane ( 33 ), no Finora è stata proposta la traduzione nella pratica clinica. Quando si considerano gli studi GWAS, le varianti identificate non sono state replicate in diverse coorti di pazienti, essendo le poche varianti genetiche insufficienti per descrivere completamente un fenotipo complesso come la risposta alle radiazioni. I nostri risultati non fanno eccezione, essendo le varianti genetiche identificate tramite WES non specifiche dei due gruppi di pazienti analizzati (NoSTox e STox), non consentendo di conseguenza la stratificazione fenotipica dei pazienti. Inoltre, quando abbiamo cercato di trovare nel nostro dataset le varianti precedentemente descritte nel GWAS già pubblicato, non abbiamo osservato nessuna di esse, rafforzando ancora una volta il fatto che la semplice analisi delle varianti genetiche non può spiegare i fenotipi multifattoriali. Quindi, consapevoli che un fenotipo complesso non può essere sbrogliato semplicemente confrontando la distribuzione delle varianti genetiche in due gruppi, considerando anche il basso numero di pazienti analizzati che contribuiscono alla pressione statistica e al fallimento dell'associazione, abbiamo utilizzato un nuovo approccio computazionale volto a descrivere i percorsi specifici per ogni gruppo di pazienti. In tal modo, grazie all'analisi dell'arricchimento variabile, siamo stati in grado di identificare percorsi presenti solo nei gruppi NoSTox o STox; una firma di percorso è stata riconosciuta in NoSTox o STox. Sulla base della nostra analisi di arricchimento variabile, qui descriviamo i diversi percorsi associati agli esiti della radioterapia considerati (nessuna/tollerabile o tossicità polmonare grave), la cui rilevanza è supportata anche dalla letteratura. 4.1 Nessuno/Gruppo di tossicità tollerabile Quattro percorsi, correlati a processi infiammatori e fibrotici, possibilmente coinvolti nello sviluppo di tossicità polmonare, sono stati interrotti in silico nei pazienti noSTox. Altri percorsi interrotti erano correlati a processi biologici più generali non specificamente correlati ai fenotipi dei pazienti. I quattro percorsi sono i seguenti: 1. Via di segnalazione NFkappaB indotta da TNFR1 (R-HSA-5357956) Il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) è espresso rapidamente e in modo persistente nei tessuti irradiati e adiacenti ( 34 ). Può innescare più vie di segnale ( 35 ), inclusa l'attività di segnalazione di NFkB, che ha una forte azione/funzione proinfiammatoria e quindi deve essere strettamente controllata per prevenire l'infiammazione persistente. Un meccanismo che contribuisce a garantire un controllo adeguato di NFkB include l'ubiquitinazione ( 36 , 37 ). TNF-α è stato implicato in mucosite radiazioni, enterite, e dermatiti ( 30 , 38 - il 40 ), e la sua carenza in un modello di danno polmonare ha dimostrato di prevenire i sintomi di polmonite attinica ( 41 ). Una variazione funzionale si trova nella via di segnalazione NfkappaB indotta da TNFR1: un inserimento frameshift nel gene UBC. La proteina codificata da questo gene è un'ubiquitinasi (ubiquitina C). Sebbene i cambiamenti complessivi nei livelli cellulari di ubiquitina in risposta alle radiazioni ionizzanti siano ancora poco conosciuti, Tang e colleghi hanno dimostrato che la sottoregolazione dell'ubiquitina C riduce l'espressione di NF-kB indotta dalle radiazioni e ne inibisce la traslocazione nel nucleo ( 42 ), suggerendo che dopo l'irradiazione , il silenziamento della de-ubiquitinazione può sopprimere la risposta cellulare alle radiazioni indotta da NF-kB. 2. La via dell'inflammasoma AIM2 (R-HSA-844615) Una delezione frameshift nel gene AIM2 è stata rilevata nel paziente n. 16; inoltre, è stata osservata una variante su PYCARD nel paziente n. 84. AIM2 è un sensore immunitario innato che media l'assemblaggio e l'attivazione dell'inflammasoma in risposta alle rotture del DNA a doppio filamento ( 43 , 44 ). L'inflammasoma AIM2 sensibile al DNA controlla la morte cellulare indotta dalle radiazioni e il danno tissutale ( 45 ). In un modello di ratto di polmonite da radiazioni (RP), la radioterapia ha aumentato il livello di espressione di mRNA di AIM2, che ha ulteriormente innescato il rilascio di IL-1β e ha indotto RP ( 40), suggerendo che l'attivazione dell'inflammasoma AIM2 mediante radioterapia può contribuire alla patogenesi della RP. È interessante notare che la carenza di inflammasoma AIM2 ha dimostrato di proteggere i topi dalla sindrome dell'intestino tenue indotta dalle radiazioni e dall'insufficienza ematopoietica ( 45 ). Inoltre, il gene PYCARD (noto anche come ASC) codifica per una proteina adattatrice che media l'assemblaggio di grandi complessi di segnalazione che rappresentano un passaggio critico nell'iniziare le risposte dell'inflammasoma ( 46 ). 3. La via della cascata di segnalazione del recettore dell'insulina (R-HSA-74751) è stata interrotta in 4 pazienti NoSTox Esiste un alto grado di omologia strutturale tra il recettore dell'insulina (IR) e il recettore del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) (IGF-1R), che segnala tramite molti mediatori comuni ( 47 ). Le radiazioni ionizzanti attivano diversi recettori tirosin-chinasi coinvolti nella risposta al danno del DNA, incluso l'IGF-1R ( 48 ), probabilmente promuovendo uno stato profibrotico. Inoltre, la disregolazione dell'asse del fattore di crescita insulino-simile (IGF) è stata implicata nella patogenesi della fibrosi nelle malattie polmonari ( 49 – 52). Il fattore di crescita insulino-simile 2 (IGF-2) promuove la fibrosi attraverso IGF1R, IR e IGF1R/IR, differenzia i fibroblasti in miofibroblasti, riduce la produzione di proteasi e la degradazione della matrice extracellulare e stimola l'espressione di due fattori di crescita trasformanti β (TGF-β) isoforme, suggerendo che IGF-2 può esercitare effetti profibrotici attraverso molteplici meccanismi ( 53 ). 4. Biosintesi del plasmalogeno (R-HSA-75896) Prove recenti suggeriscono che i raft colesterolo-sfingolipidi potrebbero svolgere un ruolo nella segnalazione dell'insulina tramite IR ( 54 ). Il potenziale contributo dei lipidi alla segnalazione dell'insulina è interessante poiché è stato dimostrato che la via di biosintesi del plasmalogeno ha anche un potenziale impatto sui fenotipi dei pazienti NoSTox, portati dai pazienti #50, #66 e #88 che non hanno sviluppato gravi tossicità polmonari. I plasmalogeni rappresentano una classe di fosfolipidi che si trovano ubiquitariamente in quantità considerevoli come costituenti delle membrane cellulari dei mammiferi e significativamente arricchiti nelle zattere lipidiche ( 55 , 56), microdomini funzionali nelle membrane cellulari, che possono influenzare la trasduzione del segnale. Pertanto, l'interruzione della biosintesi del plasmalogeno potrebbe influenzare la segnalazione transmembrana dell'insulina, creando così un ponte funzionale tra questa via e i meccanismi patogenetici della tossicità delle radiazioni. Inoltre, Laiakis e colleghi ( 57 ) hanno studiato gli effetti delle radiazioni ionizzanti sul livello ematico di metaboliti e lipidi, dimostrando che l'esposizione acuta alle radiazioni in un modello murino induceva una mobilizzazione specifica dei plasmalogeni. Sebbene il ruolo patologico dei plasmalogeni e le vie biochimiche alla base della loro sovraregolazione dopo l'esposizione alle radiazioni rimangano da chiarire, Braverman e Moser hanno suggerito una specifica biofirma lipidomica sierica come indicatore dell'esposizione alle radiazioni ( 58). Sulla base dei risultati dei percorsi nei soggetti NoSTox, abbiamo ipotizzato che il danno funzionale nel controllo dell'espressione indotta dalle radiazioni di NF-kB, principalmente nei/dei meccanismi di ubiquitinazione/deubiquitinazione, insieme a un danno del percorso dell'inflammasoma AIM2 e una disregolazione dell'asse del fattore di crescita insulino-simile (IGF) (possibilmente correlato a una biosintesi del plasmalogeno alterata), potrebbe modulare l'infiammazione polmonare indotta da radiazioni prevenendo lo sviluppo di polmonite acuta da radiazioni e fibrosi polmonare cronica indotta da radiazioni ( Figura 1 ). FIGURA 1 Figura 1 (A)L'analisi dell'arricchimento delle varianti eseguita su individui che hanno sviluppato tossicità polmonare indotta da radiazioni nulla/tollerabile suggerisce che il danno funzionale (frecce tratteggiate) nelle vie coinvolte nel controllo dell'espressione indotta da radiazioni di NF-kB (freccia tratteggiata verde = segnalazione NFkB indotta da TNFR1 pathway, variante funzionale correlata: 2/c.2051dupG) e attivazione dell'inflammasoma AIM2 (freccia tratteggiata gialla = l'inflammasoma AIM2, variante funzionale correlata: c.712delA, variante di impatto correlata: c.C278G), e del fattore di crescita insulino-simile (IGF) (freccia tratteggiata blu = cascata di segnalazione del recettore dell'insulina, varianti funzionali correlate: 1/c.38_39insC, 1/c.37_38insC, 1/c.37_38insC e 1/c.C447), possibilmente correlato a un plasmalogeno alterato biosintesi (attow punteggiato rosso = biosintesi del plasmalogeno, varianti di impatto correlate: 9/c.G1300A, 9/c.C1240T,e 1/c.A83T), potrebbe svolgere un ruolo nella prevenzione dello sviluppo di polmonite acuta da radiazioni e fibrosi polmonare cronica indotta da radiazioni.(B) L' analisi dell'arricchimento delle varianti eseguita su individui che hanno sviluppato una grave tossicità polmonare indotta da radiazioni suggerisce che, influenzando sia l'attività fibrinolitica (freccia bianca = dissoluzione del coagulo di fibrina, variante funzionale coinvolta: 4/c.C169T) sia le vie di modifica dell'RNA (luce freccia blu = formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR, variante di impatto coinvolta: 2/c.C577G), varianti specifiche in geni coinvolti in queste vie potrebbero essere responsabili dei gravi eventi di tossicità riportati da alcuni pazienti dopo l'irradiazione. 4.2 Gruppo di tossicità grave Lo stesso approccio basato sui percorsi interrotti dal rilevamento è stato utilizzato per il gruppo Stox. Sono stati trovati due percorsi interrotti, con potenziale impatto sui fenotipi dei pazienti Stox: 1. La dissoluzione della via del coagulo di fibrina (R-HSA-75205) È stata identificata una variante correlata a questo percorso: una variante di ripiego nel gene SERPINF2 nel paziente n. 2, che ha sviluppato un evento tromboembolico. L'irradiazione attiva l'attività procoagulante e riduce l'attività fibrinolitica ( 59 ) in modelli animali di irradiazione toracica, suggerendo il coinvolgimento della coagulazione e della fibrinolisi nel danno polmonare indotto dalle radiazioni ( 60 ). Il gene SERPINF2 codifica per un membro della famiglia degli inibitori della serina proteasi delle serpine, l'alfa 2 antiplasmina (α2-AP), che, insieme all'inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), è il principale inibitore diretto dell'attività fibrinolitica. L'alfa2-antiplasmina svolge un ruolo significativo nell'embolia polmonare acuta ( 61 ) ed è stato dimostrato che i pazienti con embolia polmonare mostrano un tasso più elevato di degradazione del coagulo di fibrina ( 62 )). La compromissione dell'attività dell'Alpha2-antiplasmina da parte della variante stopgain nel gene SERPINF2, eventualmente potenziando l'attività fibrinolitica, potrebbe quindi essere coinvolta nello sviluppo dell'evento tromboembolico polmonare osservato nel paziente 2#. 2. Formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR (R-HSA-77042) Una variante non sinonima ad alto impatto nel gene ADAR, coinvolta nella formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR, è stata portata dal paziente n. 94, che è progredito verso la fibrosi di alto grado. La modifica post-trascrizionale dell'RNA è un processo chiave che controlla l'output del genoma e la deaminazione delle adenosine (A) in inosine (I) è l'evento principale di modifica dell'RNA negli esseri umani, catalizzato dall'adenosina deaminasi che agisce sulla famiglia dell'RNA (ADAR). di proteine ( 63 ). Gli effetti delle radiazioni sull'editing dell'RNA sono poco conosciuti; Liu e colleghi hanno riferito che dopo/dopo la radiazione di particelle α, i siti di editing dell'RNA cambiano notevolmente e la loro quantità totale diminuisce dopo la radiazione ( 64 ). È stato determinato che l'espressione di ADAR è tessuto specifica, essendo il polmone il secondo sito più altamente esprimente, in termini di espressione tissutale ( 65 , 66). L'analisi dell'editore dell'RNA (R-HSA-77042) della fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e dei polmoni normali ha rivelato una maggiore frequenza di editing nell'IPF rispetto ai polmoni normali, suggerendo un ruolo per l'editing disregolato nella patogenesi dell'IPF ( 67 ). È stato scoperto che l'espressione di ADAR1 e ADAR2 è downregolata nei fibroblasti di pazienti con IPF ( 68 ). I cambiamenti nei livelli di espressione di ADAR1 e ADAR2 possono rappresentare un importante meccanismo di controllo nell'IPF, regolando l'elaborazione di miRNA chiave come il miRNA-21. La sovraespressione di miRNA-21 nel tessuto polmonare e nei fibroblasti polmonari di pazienti con IPF può essere dovuta a un editing difettoso da parte di ADAR ( 66). Questo miRNA mira alla sintesi proteica antifibrosante come il membro della famiglia SMAD 7, il recettore beta TGF 2 (TGF-βR2), l'inibitore della metallopeptidasi TIMP 3 (TIMP3) e il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A) ( 69 , 70 ). Il crosstalk tra i percorsi di impatto che controllano l'editing dell'RNA (R-HSA-75064 e R-HSA-77042) potrebbe contribuire all'induzione della grave fibrosi polmonare osservata nel paziente n. Presi insieme i risultati del percorso dei pazienti Stox, ci portano ad ipotizzare che specifiche varianti nei geni che influenzano sia l'attività fibrinolitica che le vie di editing dell'RNA, potrebbero essere responsabili dei gravi eventi di tossicità riportati, dopo irradiazione, da alcuni pazienti del gruppo Stox, che presentano queste varianti specifiche ( Figura 1 ). 5 Conclusione e prospettive future I nostri risultati WES non hanno mostrato alcuna variante genetica specifica associata ai fenotipi NoSTox e Stox, confermando così che l'approccio dello studio di associazione non è utile quando si considerano fenotipi complessi come la risposta alla radioterapia; tuttavia, i risultati ottenuti dall'analisi dell'arricchimento variante indicano diverse firme di percorsi che caratterizzano i pazienti NoSTox e Stox, consentendo di formulare ipotesi sulla protezione dagli effetti collaterali derivati dalla radioterapia nonché dai fattori che predispongono a una peggiore risposta al trattamento. Naturalmente, siamo consapevoli che il nostro studio soffre della limitazione legata al piccolo numero di pazienti analizzati, e della mancanza di dati trascrittomici, non disponibili a causa dell'impossibilità di raccogliere campioni biologici polmone/pleurici per il sequenziamento dell'RNA, per ricontrollare il nostro ipotesi. La possibilità di identificare i pazienti che, sulla base delle loro firme di percorsi, potrebbero rispondere meglio alla radioterapia rappresenta una futura applicazione traslazionale, una volta convalidate le firme su altri gruppi di pazienti. Consentendo l'identificazione precoce dei pazienti a rischio di tossicità polmonare dipendente dal trattamento, lo strumento predittivo basato sul percorso potrebbe svolgere un ruolo nella progettazione di nuove combinazioni terapeutiche, tra cui l'immunoterapia e la RT. Infatti, il trattamento di prima linea con nivolumab più ipilimumab è stato recentemente proposto nel MPM non resecabile, per migliorare l'OS rispetto alla chemioterapia. La potenziale sinergia di RT e immunoterapia, già osservata in altri tumori ( 71), potrebbe non solo migliorare ulteriormente la risposta clinica nella MPM, ma anche aumentare il rischio di effetti collaterali, condivisi da entrambi i trattamenti, come la polmonite ( 72 ). In questo contesto, la caratterizzazione genomica del pretrattamento potrebbe aiutare a prevenire lo sviluppo di gravi effetti collaterali contribuendo alla definizione di un trattamento personalizzato. Dichiarazione sulla disponibilità dei dati I set di dati presentati in questo studio possono essere trovati online nel repository SRA di PRJNA768626 id: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA768626 . Dichiarazione etica Questo studio prospettico, che coinvolge partecipanti umani, è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico locale (Comitato Etico Indipendente del CRO di Aviano, CRO-2013-38). I pazienti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio. Il servizio di biobanca CRO ha gestito e conservato tutti i campioni biologici prima dell'uso per il presente progetto (autorizzazione per le analisi ottenuta tramite protocollo numero 6825/D). Contributi dell'autore SC e VB hanno concepito l'idea originale e redatto il manoscritto. AR ha acquisito i dati e ha contribuito all'interpretazione dei risultati. RM e LB hanno eseguito l'analisi genetica e l'interpretazione dei dati. ElM e GZ hanno contribuito alla versione finale del manoscritto, hanno fornito feedback critici e hanno contribuito a dare forma alla ricerca. AS, MT, EmM e PZ hanno aiutato a supervisionare il progetto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale. Finanziamento Questo lavoro è stato finanziato dalla Lega Italiana per la Lotta contro i Tumori (LILT), ASSOCIAZIONE ISONTINA LILT (Bando di Ricerca sanitaria 2017-programma 5 per mille anno 2015) e dal Comune di Monfalcone (Gorizia). Conflitto d'interesse Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che possano essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi. Nota dell'editore Tutte le affermazioni espresse in questo articolo sono esclusivamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente quelle delle loro organizzazioni affiliate, o quelle dell'editore, degli editori e dei revisori. Qualsiasi prodotto che può essere valutato in questo articolo, o affermazione che può essere fatta dal suo produttore, non è garantito o approvato dall'editore. Ringraziamenti Siamo grati allo staff di CRO-biobank per il loro supporto nel reclutamento dei pazienti e nella gestione/preparazione dei campioni. Ringraziamo Alessandra Knowles per la revisione critica del manoscritto. Materiale supplementare Il materiale supplementare per questo articolo è disponibile online all'indirizzo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.784081/full#supplementary-material