Progetto di ricerca scientifica sull’asbesto

Nell’area Giuliana, le provincie di Trieste e Gorizia con un’appendice verso il territorio della Bassa Friulana, il mesotelioma pleurico maligno, presenta attualmente un’incidenza tra le più alte in Italia e nel resto dell’Europa. La neoplasia in queste aree, già letteralmente ben descritta è dovuta in particolare all’intensa esposizione all’asbesto, almeno fino all’inizio degli anni ‘90, nei siti industriali di Trieste e Monfalcone e principalmente nei cantieri navali e nei porti delle due città.
Se in precedenza si supponeva che il mesotelioma colpiva solo i lavoratori, diversi studi hanno dimostrato che il male si può sviluppare tra i componenti del nucleo famigliare del lavoratore, o in persone che nulla hanno avuto a che fare con la manipolazione o l’esposizione diretta con l’asbesto.

Pertanto, come Sezione LILT, avendo diversi associati di famigliari deceduti a causa del micidiale minerale e, per il continuo contatto con Reparti e Uffici dedicati dall’Azienda Sanitaria a tale male, ci siamo sentiti la responsabilità e il dovere di svolgere il nostro ruolo sociale sulla prevenzione anche, aiutando la ricerca, come quella descritta qui sotto.

Il presidente della Sezione Isontina, Cav. Umberto Miniussi, dopo varie interlocuzioni con soci e personale scientifico, intende continuare in Sezione l’attività di ricerca. La proposta trova interesse a livello di LILT Nazionale, tanto che il 15 novembre 2017 ha presentato domanda di finanziamento per il Progetto di ricerca denominato “Omeostasi del ferro a livello polmonare e patologie asbesto correlate: nuovi approcci per lo screening della popolazione degli esposti” di cui la responsabile scientifica è la prof.ssa Violetta Borelli. Mentre tra i partners figurano le sezioni LILT di Trieste e di Udine.

19 aprile 2018, il progetto è ammesso a finanziamento, ottenendo un contributo di € 80.000,00, erogati da LILT secondo le seguenti modalità: 60% al momento della notifica da parte della Sezione di Gorizia; 40% all’approvazione da parte di apposita Commissione nazionale LILT della relazione finale e della relativa rendicontazione contabile.
L’amministrazione comunale di Monfalcone, giunta a conoscenza del finanziamento del suddetto progetto, ha chiesto al Presidente LILT un approfondimento sui contenuti, le modalità di svolgimento dell’attività di ricerca e le ricadute sul territorio Isontino. Il presidente Miniussi e la prof.ssa Borelli hanno presentato al Sindaco del Comune di Monfalcone, dr.ssa Anna Maria Cisint, le attività di ricerca svolte finora dalla Sezione e della collaborazione con l’Unità Operativa Anatomia Patologica dell’Azienda per l’Assistenza Sanitaria N.2 Bassa Friulana-Isontina (AAS2), su cui si basa l’attuale progetto LILT. I risultati di quella collaborazione sono stati pubblicati su: Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 2018, 81, 98-105, e hanno fornito le basi su cui è stato sviluppato il progetto della dr.ssa Borelli e della Sezione LILT.
Il Sindaco in quella sede dichiarò il suo interesse per l’attività della Sezione LILT e per quanto scientificamente presentato. Dichiarando di cofinanziare il progetto. Inoltre il Sindaco sottolineò la volontà di sostenere il lavoro condotto dall’AAS2 nella raccolta, classificazione e catalogazione di campioni di tutti i casi di patologie asbesto correlate, in continuità con l’attività svolta dal prof. Claudio Bianchi, già presidente della Sezione LILT.

Nel luglio 2018 sono state intraprese le pratiche per la stipula di una convenzione LILT-Dipartimento Scienze della Vita dell’Università di Trieste, finalizzata all’attivazione di un assegno di ricerca per attività da svolgersi nell’ambito del suddetto progetto. Dopo alcuni mesi, al momento della firma della convenzione, il Cav. Umberto Miniussi chiese di aggiungere una clausola che consentisse alla LILT di poter disporre dei risultati derivanti dalle attività dell’assegnista, potendoli divulgare liberamente, modificando perciò l’articolo 9, “Norma finale” della Convenzione LILT-DSV Università, che originariamente recitava: “I risultati, brevettabili o no, ottenuti dall’esecuzione della collaborazione – delle collaborazioni, oggetto della presente Convenzione, rimarranno di proprietà dell’Università, la quale ne potrà disporre pienamente”. Furono quindi effettuati diversi quanto inutili tentativi di dirimere la questione. A fronte della manifesta difficoltà a modificare il testo come richiesto, il Cav. Umberto Miniussi decise di non sottoscrivere la convenzione. (Tutti questi passaggi sono documentabili in base allo scambio di email tra i vari attori).

In Ottobre 2018 la Sezione LILT, dovendo iniziare la ricerca, di fronte all’urgenza di reclutare un ricercatore dedicato, decide di percorrere la via intrapresa nel 2014 da un’altra Onlus, l’AEA di Monfalcone. Il Cav. Minuissi ha quindi preso contatti con il Direttore scientifico della “Fondazione Callerio”, Prof. G. Sava, per discutere la possibilità di stipulare un accordo di collaborazione per l’attività di ricerca relativa al progetto LILT. Soluzione che trova ostacoli nel Consiglio Direttivo della Fondazione, tanto che, l’accordo svanisce. Intanto il quotidiano locale “Il Piccolo”, in data 8 novembre, pubblica un articolo in cui il Comune di Monfalcone dichiara la volontà di cofinanziare il progetto LILT con 40.000,00 euro, cui segue il 20 novembre una conferenza stampa, allo scopo di dare giusto e reale risalto alla ricerca ed alle strutture coinvolte.
Nella conferenza, tenutasi presso la sede comunale di Monfalcone, sono stati illustrati i contenuti del progetto LILT mentre il Sindaco di Monfalcone ha ribadito la disponibilità del Comune a sostenere finanziariamente la ricerca con un assegno diretto alla Sezione LILT.

A fine novembre 2018 c’è il progetto, ci sono i soldi ma, manca il ricercatore dedicato, Miniussi si trova a dover decidere e, consultati i Revisori del Conto dell’Associazione, assume con contratto a tempo determinato dal gennaio 2019 e per sei mesi il ricercatore dott. Fulvio Celsi.

Inizia così la prima parte della ricerca. Con i risultati che si stanno ottenendo viene rinnovato il contratto del ricercatore per ulteriori sei mesi e fino a dicembre 2019. Nel contempo, visto il buon andamento della ricerca viene assunta da settembre 2019, a tempo determinato per 12 mesi la ricercatrice dr.ssa Paola Zacchi.

La prima parte della ricerca, il 22 novembre 2019, viene pubblicata sulla rivista scientifica “Journal of Toxicology and Environmental Health, Part. A” dal titolo: Pleural Mesothelioma and lung cancer: the role of asbestos exposure and genetic variants in selected iron metabolism and infiammation genes. (F. Celsi, R. R. moura, M. Schnaider, F. Vita, L. Finotto, G. Zabocchi, P. Zacchi e V. Borelli)

“Ruolo di alcune varianti genetiche nello sviluppo del carcinoma polmonare e del mesotelioma in soggetti esposti all’amianto”.

In questo studio effettuato dal nostro gruppo di ricerca (Celsi et al., Plureal mesothelioma and lung cancer: The role of asbestos exposure and genetic variants in selected iron metabolism and infiammation genes; Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A: Current Issues) è stato indagato il rapporto tra la presenza di varianti a carico di geni coinvolti nel metabolismo del ferro e la probabilità di sviluppare mesotelioma pleurico o carcinoma polmonare in individui esposti all’amianto.

Lo studio fa parte di una linea di ricerca già parzialmente indagata in precedenza, con la scoperta che alcune varianti in geni legati al metabolismo del ferro possono diminuire la probabilità di sviluppare mesotelioma in seguito all’esposizione all’amianto. Lo studio attuale amplia e conferma le conclusioni precedenti, prendendo in esame un nuovo gruppo di individui affetti da mesotelioma e includendo nell’analisi un gruppo di individui che hanno sviluppato il carcinoma polmonare.

Appare così rafforzato il ruolo di alcune varianti genetiche nel diminuire la probabilità dello sviluppo di tumori polmonari e pleurici, in particolare le mutazioni presenti sul gene HEPH, che codifica per una proteina chiamata “Efestina” legata all’assorbimento del ferro a livello intestinale.

Lo studio è stato reso possibile alla collaborazione con le strutture di Anatomia Patologica (sedi di Gorizia e Monfalcone) e di prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro dell’AAS2 “Bassa Friulana-Isontina”. Grazie all’intensa attività di indagine del prof. Claudio Bianchi e dei suoi successori presso l’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone, è presente infatti un’importante archivio di tessuti provenienti da individui esposti all’amianto, sui quali è stato possibile effettuare l’analisi genetica.

Questo studio rappresenta un ulteriore passo avanti nel determinare il contributo delle caratteristiche genetiche individuali nell’insorgenza delle neoplasie asbesto-correlate negli ex-esposti. Individuare un’associazione tra determinate varianti genetiche e la suscettibilità individuale verso lo sviluppo di neoplasie amianto-correlate consentirebbe di programmare la sorveglianza sanitaria degli ex-esposti all’amianto secondo uno schema graduato, secondo un rapporto costi-benefici “personalizzato”, consentendo di anticipare diagnosi e trattamento al fine di migliorare la sopravvivenza e la qualità della vita dei pazienti.

Dopo la pubblicazione sulla prestigiosa rivista, in dicembre, presso la Sala Consiliare del Municipio di Monfalcone, viene presentata dalla prof.ssa Borelli e dai ricercatori la prima parte della ricerca e gli obiettivi per la seconda parte.

Secondo anno, obiettivi del progetto

Studi genetici

  • Analisi dell’esoma finalizzata ad evidenziare varianti genetiche protettive o associate ad un maggiore rischio di sviluppare neoplasie (mesotelioma pleurico maligno e carcinoma polmonare) in seguito all’esposizione all’asbesto.
  • Analisi dell’esoma finalizzata ad evidenziare varianti genetiche predittive alla risposta alla radioterapia ad alte dosi per il mesotelioma pleurico: i test genetici come strumenti della radioterapia personalizzata.

Studi funzionali: biologia molecolare e cellulare

  • Analisi immunoistochimica della distribuzione tessutale dell’efestina e analisi cellulare dei cambiamenti a carico del metabolismo del ferro indotti da mutazioni nel gene per l’efestina (heph)

Ad aprile 2020 mentre il progetto continua ad implementarsi, viene osservato con interesse da diversi Centri scientifici e Universitari in Regione e nel resto della Nazione, a seguito di interlocuzioni verbali viene stipulato un accordo tra il neo presidente della Sezione LILT dott. Michele Luise e il Direttore del Dipartimento di Scienze della Vita, prof. Mauro Tretiach, per il finanziamento all’Università degli Studi di Trieste di un posto di assegno di ricerca per il settore scientifico-disciplinare MED/04 per il programma di ricerca “Omeostasi del ferro a livello polmonare e patologie asbesto correlate: nuovi approcci per lo screening della popolazione degli esposti”.

Il responsabile LILT della ricerca, Cav. Miniussi, vede innalzarsi quanto proposto e costruito nel 2017 al momento del suo massimo incarico in Lilt. Tutto è stato possibile grazie all’aiuto concreto dell’Amministrazione Comunale di Monfalcone, di associazioni o cittadini del Territorio (Anfi Gorizia, Fam. Boscarol-Zuberti, i sig. Mariano, Vesna, Fantuzr, Violin e altri), pertanto ulteriori passi su questa ricerca possono essere ancora fatti se troveremo ancora interesse e sostegno.

Ci sono prospettive e attese da questa ricerca per salvare o perlomeno aumentare il periodo di vita di soggetti colpiti dall’asbesto. Nel contempo continuiamo ad essere critici con chi non ha mai inteso aiutare questa ricerca e i volontari impegnati nell’aiuto verso i malati di asbesto e le loro famiglie, anche perché i colpiti dalle fibre di amianto continuano ad ammalarsi e morire per colpa di un sistema industriale portato al profitto e all’interesse personale.

Il progetto continua mentre la prima è ripresa e pubblicata su una rivista scientifica a livello internazionale.

Da gennaio 2021 lo studio prosegue sull: ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA DELLA DISTRIBUZIONE TESSUTALE DELL’EFESTINA e ANALISI CELLULARE DEI CAMBIAMENTI A CARICO DEL METABOLISMO DEL FERRO INDOTTI DA MUTAZIONI NEL GENE PER L’EFESTINA (HEPH).

PREMESSA

E’ ben noto il ruolo giocato dal ferro nel danno polmonare indotto dalle fibre di asbesto. Il nostro gruppo di ricerca (nel corso del precedente progetto finanziato dal Bando di ricerca sanitaria LILT 2017) ha valutato la presenza di polimorfismi genici su 10 geni coinvolti nel metabolismo del ferro analizzando campioni di DNA estratti da tessuti autoptici di pazienti esposti all’asbesto deceduti per aver sviluppato il mesotelioma pleurico maligno o il carcinoma polmonare, e confrontandoli con quelli ottenuti da pazienti esposti ma deceduti in tarda età per patologie non-asbesto correlate. Da questa analisi genomica è emersa la presenza di una mutazione protettiva nei confronti del mesotelioma e del carcinoma polmonare presente nel gene che codifica per la proteina efestina [Crovella et al, 2016: Celsi et al, 2019].

L’efestina è una proteina appartenente alla famiglia delle ferro-ossidasi il cui accoppiamento funzionale con la proteina canale Ferroportina (anche nota come SLC40A1) permette di ridurre la concentrazione di ferro citosolica attraverso il trasporto del ferro ferroso (Fe2+) nell’ambiente extracellulare [Vashchenko & MacGillivray, 2013]. Tale trasporto viene utilizzato dagli enterociti della mucosa intestinale allo scopo di promuovere l’immissione fisiologica nel circolo sanguigno del ferro assunto attraverso l’alimentazione e sua successiva distribuzione ai diversi tessuti una volta che il ferro ferroso viene ossidato a ferro ferrico (Fe3+) e quindi caricato dalla proteina serica transferrina [Yeh et al., 2011]. A livello cellulare tale via di trasporto del ferro è vista quale meccanismo di protezione nei confronti di un eccessivo accumulo citosolico di Fe2+, catalizzatore di radicali liberi e di conseguente danno genotossico [Valko et al., 2016]. A supporto di tale ruolo protettivo della via di uscita del ferro cellulare, recentemente è stato dimostrato che l’espressione dell’efestina risulta fortemente diminuita nei tumori più aggressivi della mammella (Wang et al., 2017). La forma mutata dell’efestina da noi identificata porta alla sostituzione dell’aminoacido Acido Aspartico in posizione 571 con l’Istidina, amino acido caratterizzato dalla presenza di una catena laterale imidazolica, generalmente utilizzata per strutturare un sito di legame per metalli di transizione come il ferro ed il rame. Le conseguenze funzionali che tale mutazione comporta sono a tutt’oggi non conosciute come del resto poco caratterizzata è l’espressione dell’efestina nei diversi tessuti dell’uomo aldi fuori del tessuto intestinale. Attualmente, nell’uomo, la sua distribuzione e funzione sono note solo a livello intestinale [Vashchenko G & MacGillivray, 2013], mentre non vi sono studi attendibili riguardo alla sua distribuzione e funzione in altri tessuti ed in particolare a livello dell’apparato respiratorio. Si ritiene comunque che in questi siti la presenza di efestina sia associata ad una sorta di protezione nei confronti dello stresso ossidativo [Wang et al, 2017].

OBBIETTIVI:

Con questo studio ci proponiamo i seguenti l’obbiettivi:

1) una analisi dettagliata della distribuzione della ferrossidasi efestina nei tumori asbesto-correlati, principalmente MPM e adenocarcinoma polmonare, in rapporto al tessuto sano;

2) dipanare il meccanismo molecolare che sottende alla “protezione” nei confronti delle patologie tumorali asbesto-correlate esercitata dalla efestina mutata in posizione 571.

DISEGNO DELLO STUDIO

Obiettivo 1: analisi immunoistochimica della distribuzione tessutale della proteina efestina in diversi tessuti umani.

Nell’uomo la distribuzione e funzione dell’efestina è stata ben caratterizzata solo a livello dell’intestino. In considerazione del possibile ruolo protettivo nei confronti delle patologie asbesto-correlate di una sua variante (evidenziata dai precedenti studi genetici), in questo studio intendiamo innanzitutto caratterizzare la distribuzione dell’efestina nei tessuti implicati nell’insorgenza delle patologie asbesto-correlate (contemplate nella Lista 1 dell’INAIL): polmone, pleura, laringe e ovaio nella popolazione non esposta e non affetta da patologie asbesto-correlate, in modo da costruire una mappa di distribuzione in una popolazione di riferimento.

Successivamente intendiamo valutare eventuali variazioni nella distribuzione ed intensità di espressione di questa proteina in relazione all’esposizione all’amianto e all’insorgenza o meno di patologie asbesto correlate.

Al fine di costruire una mappa di distribuzione dell’efestina in diversi tessuti in condizioni normali e in condizioni patologiche, legate all’esposizione all’amianto, verrà effettuato uno studio sulla distribuzione di questa proteina nei diversi tessuti di due gruppi di individui deceduti nel periodo 1990-2015 e residenti nella stessa area geografica (provincia di Gorizia):

  • soggetti non esposti all’asbesto e deceduti per patologie non correlabili all’amianto (NE)
  • soggetti esposti all’asbesto, deceduti per mesotelioma pleurico maligno (MPM), carcinoma polmonare (CP), carcinoma alla laringe (CL), carcinoma ovarico (CO).

Numerosità del campione: non essendo disponibili dati relativi alla distribuzione della proteina efestina in altri distretti corporei al di fuori dell’apparato intestinale, non è al momento definibile il

numero totale dei soggetti arruolabili. Nell’ottica della definizione del corretto sample size, è pertanto prevista, al raggiungimento dell’analisi dell’espressione dell’efestina nei diversi distretti corporei in 50 campioni NE, un’analisi ad interim dei dati acquisiti. Individuata quindi la variabilità interindividuale nell’espressione della proteina, sarà possibile determinare il numero di campioni necessari per evidenziare variazioni statisticamente significative nei diversi gruppi.

Caratteristiche dei due gruppi (si veda la scheda di raccolta dati alla fine del documento):

  • Variabili demografiche.

Ogni campione appartenente ai tre gruppi sarà corredato dai seguenti dati relativi alle variabili demografiche (età al decesso, sesso) e allo stile di vita (fumatore o non fumatore). I campioni dei diversi gruppi verranno appaiati in base a queste caratteristiche.

  • Caratteristiche cliniche.

La diagnosi di MPM, CP, CL e CO è ottenuta mediante esame istologico e analisi immunoistochimica.

  • Caratteristiche espositive.

Le caratteristiche di esposizione [domestica, professionale (cantieristica, edilizia, marina ecc…), extra-lavorativa (es. hobbies) o ambientale] sono determinate sia

(1) dai dati occupazionali forniti dal Servizio di Prevenzione e Sicurezza degli Ambienti di Lavoro dell’Azienda sanitaria universitaria Giuliano Isontina (ASU GI), sia

(2) in base agli indicatori biologici di esposizione analizzati presso l’ASUGI (corpuscoli di asbesto polmonari) e presso l’ARPA di Milano (corpuscoli e fibre di asbesto polmonari).

La stima dell’esposizione cumulativa ad asbesto degli ex-esposti (lavoratori) attraverso l’analisi del carico polmonare degli indicatori biologici (corpuscoli e fibre di amianto) è largamente impiegata nell’ambito dei procedimenti penali in corso; inoltre consente di caratterizzare con precisione ed in modo obbiettivo l’esposizione fornendo un parametro indispensabile nella selezione dei campioni per le indagini a scopi di ricerca. Attualmente la determinazione del carico polmonare di asbesto  viene commissionata dalla Procura della Repubblica (nel corso delle proprie indagini) all’Azienda Sanitaria n.2, dove viene effettuata l’analisi di campioni di tessuto polmonare (mediante microscopio ottico) per la determinazione dei corpuscoli di asbesto secondo la metodica standardizzata recentemente messa a punto dal Gruppo Nazionale Biofibre (RAPPORTI ISTISAN 17/12 ISSN 1123-3117), con cui il responsabile della ricerca ed il personale dell’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone collaborano da anni. La determinazione delle fibre di amianto viene invece effettuata, sul materiale allestito dell’Anatomia Patologica dell’Ospedale di Monfalcone, presso l’ARPA di Milano (mediante microscopia elettronica a scansione, SEM) sempre nell’ambito del percorso analitico delineato dal Gruppo Nazionale Biofibre.

I dati occupazionali e quelli relativi alla caratterizzazione mineralogica polmonare degli individui deceduti per malattia professionale amianto correlata iscritti in qualità di Parti Offese per l’Art. 589 C.P, presso la Procura della Repubblica di Gorizia verranno ottenuti ed utilizzati previa richiesta di autorizzazione alla Procura.

Tutte le informazioni relative ai singoli pazienti che potrebbero consentire di identificare in maniera univoca la persona verranno conservate in un database elettronico criptato. Gli individui saranno identificati con un codice univoco progressivo e la corrispondenza di questo con le informazioni personali verrà anch’essa criptata elettronicamente in rispetto delle attuali normative relative al trattamento di dati sensibili.

Per il trattamento di questi dati a fini di ricerca, inclusi anche i risultati dell’analisi genetica, non è necessaria autorizzazione, si veda l’Autorizzazione generale al trattamento dei dati personali effettuato per scopi di ricerca scientifica (n°9/2016) del 15/12/2016, concessa dal Garante per la protezione dei dati personali.

Campioni: tessuti inclusi in paraffina disponibili quali residui delle analisi autoptiche.

Tipologie tessutali:

-tessuti sede di patologie asbesto correlate riconosciute (Helsinky criteria e Lista 1 INAIL): polmone, pleura, laringe, ovaio [tessuto sano nel gruppo NE, tessuto sano (se disponibile) e patologico negli altri gruppi];

-intestino, tessuto che funge da controllo positivo di espressione della proteina efestina, in cui la sua espressione e funzione sono state ben caratterizzate.

Analisi immunoistochimica

Da ogni blocchetto di paraffina, relativo a ciascuna tipologia tessutale, verranno ottenute sezioni seriali dello spessore di 4 µm (7 sezioni per ciascun tessuto incluso). Le prime due sezioni verranno sottoposta a colorazione con Ematossilina Eosina per verificare la qualità del preparato e caratterizzare la tipologia delle strutture presenti.

La valutazione in immunoistochimica dell’efestina verrà effettuata attraverso l’impiego di due diversi anticorpi policlonali commerciali, distribuiti da Santa Cruz Biotechnology e da Invitrogen.

Verranno valutate sia l’intensità di espressione della proteina sia la tipologia di cellule che la esprimono (stroma o infiltrato immunitario). In tal caso si prevede di eseguire un approccio di doppia marcatura efestina/marker selettivo per una determinata componente monocito-macrofagica (colorazione per CD68 e CD165).

Il software della Leica “Aperio ImageScope” verrà utilizzato per la quantificazione dell’espressione dell’efestina nei preparati sottoposti ad indagine immunoistochimica.

Analisi statistica

Al fine di ottenere una distribuzione più omogenea dei campioni, saranno selezionati quelli provenienti da pazienti deceduti in un’età compresa tra 65 e 85 anni. Inizialmente, verrà analizzata l’espressione della proteina in un gruppo di 50 pazienti, in 4 tessuti diversi. Da questa prima analisi “ad interim” potrà essere calcolata la frequenza della variabilità interindividuale e quindi successivamente la numerosità campionaria.

Obiettivo 2: analisi strutturale e funzionale della forma mutata dell’efestina (mutante D571H)

Il cDNA per l’efestina wild type (wt) e per la variante da noi identificata come protettiva nei confronti del mesotelioma pleurico (mutante D571H) verranno clonati nel vettore di espressione di lievito pIB2. Questo consentirà la produzione della proteina ricombinante in lievito Pichia Pastoris e la sua successiva purificazione.

Successivamente in collaborazione con il prof. Musci (Università degli Studi del Molise) e della prof.ssa Maria Carmela Bonaccorsi di Patti (Università La Sapienza di Roma), ci proponiamo di eseguire una caratterizzazione strutturale mediante tecniche calorimetriche; proteolisi controllata della catena polipeptidica e analisi dettagliata dello stato redox dei siti del ferro e del rame sulle varianti efestina wt e mutante D571H. Tali metodologie sono state applicate con successo dal gruppo di ricerca per l’esecuzione dell’analisi funzionale della Ceruloplasmina, un ulteriore membro della famiglia delle ferrossidasi e omologo dell’efestina.

Analisi dei cambiamenti a carico del metabolismo del ferro indotti da mutazioni nel gene per l’efestina (Heph).

A questo scopo verranno utilizzate due linee cellulari per simulare il tessuto polmonare: le A549, una linea di adenocarcinoma di cellule alveolari basali e le MeT5A, una linea di mesotelio immortalizzata. In queste due linee cellulari sarà over-espressa, in modo transiente, la proteina Heph, sia in forma wild-type che in forma mutata. All’inizio verrà verificato che la proteina wild-type over-espressa non sia tossica per le cellule, controllando la vitalità cellulare con il saggio MTT.

Lo stesso test verrà ripetuto con la proteina mutata; questo saggio serve anche per ottimizzare le condizioni di trasfezione.  Sulle cellule transfettate si procederà anche a valutare la localizzazione intracellulare della proteina, che in fase di clonaggio verrà provvista di un tag FLAG, ovvero di una breve sequenza amminoacidica che permette di distinguere la proteina over-espressa rispetto a quella endogena attraverso l’utilizzo di un anticorpo commerciale ad alta affinità diretto contro il tag.

Per la caratterizzazione della distribuzione intracellulare si procederà con l’allestimento di immunofluorescenze doppie con anticorpi selettivi per i diversi compartimenti intracellulari (es. EEA1 marker endosomiale, Lamp1 marker lisosomiale, TGN38 marker dell’apparato di Golgi, rab11 marker dell’endosoma coinvolto nel reciclaggio dei recettori). La frazione di efestina presente sulla membrana plasmatica, ovvero quella funzionale per il trasporto del ferro dal citosol all’ambiente extracellulare, verrà invece determinata in maniera quantitativa attraverso saggi di biotinilazione di superficie, che prevedono l’utilizzo di una biotina chimicamente modificata e resa incapace di passare attraverso il doppio strato lipidico. Successivamente, nelle due linee cellulari trasfettate transientemente con Heph wild-type o mutata, verrà valutato lo stato di ossidazione del ferro [misurando la quantita di ione ferroso (Fe2+) o ferrico (Fe3+)] utilizzando saggi colorimetrici. Questa serie iniziale di esperimenti determinerà gli effetti nel metabolismo cellulare di una variazione di attività della Heph. Se il saggio MTT avrà messo in evidenza un’aumentata tossicità della Heph mutata, questo dato sarà ulteriormente perfezionato utilizzando il test dell’annessina/propidio per determinare se la morte cellulare e di tipo apoptotico. Questi esperimenti verranno ripetuti in presenza di diverse fibre di amianto (crisotilo, amosite, crocidolite, antofillite) caratterizzate da un diverso contenuto di ferro, allo scopo specifico di analizzare il ruolo di questo elemento in presenza di Heph mutata. In particolare si determinerà se le diverse forme di amianto giocano un ruolo importante nel cambiamento del metabolismo cellulare indotto da Heph mutata. In correlazione con questi esperimenti, il ruolo delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) verrà esaminato; i ROS possono essere generati da Fe2+ attraverso reazioni di Fenton o simili, quindi, in caso di sovraccarico di ione ferroso, e ipotizzabile un aumento di ROS. Attraverso l’uso di specifici coloranti, come la 2′,7′-dichlorodiidrofluoresceina o il diidroetidio, e possibile quantificare l’aumento di ROS indotti da sovraccarico di ferro. Questi esperimenti permetteranno dunque di correlare l’aumento di ROS con l’accumulo di ioni ferroso e ferrico, dando la possibilità di verificare l’ipotesi patogenetica (presenza di Heph mutata con o senza fibre di asbesto → accumulo ioni Fe2+ e Fe3+ → aumento ROS → morte apoptotica). Al fine di migliorare la comprensione dei meccanismi patogenetici coinvolti, nelle due linee cellulari esprimenti transientemente la proteina Heph (wild-type o mutata) verrà valutata la presenza di marcatori dell’infiammazione, specificamente interleuchina 1-b, TNF-a e IL-6, dopo esposizione ai diversi tipi di fibre di amianto. Un aumento di ROS può infatti determinare un aumento dei mediatori infiammatori, causando uno stato cronico di infiammazione, risultante in un aumentato danno tissutale. Inoltre, considerando il ruolo fondamentali dei mitocondri nel rendere il Fe biodisponibili attraverso i centri Fe-S presenti nella catena respiratoria e l’attività di produzione di ROS propria del metabolismo mitocondriale, verrà esaminata la morfologia e la distribuzione di questi organelli, attraverso tecniche di microscopia confocale.

RISULTATI ATTESI E TRASFERIBILITÀ SOCIALE 

  • Obiettivo 1: attualmente, nell’uomo non è chiara la distribuzione dell’efestina a livello polmonare e degli altri tessuti sede di patologie asbesto-correlate, né se la sua concentrazione all’interno di questi tessuti possa avere un impatto sul metabolismo del ferro e sulla crescita tumorale. Con questo studio intendiamo costruire una mappa di distribuzione dell’efestina in diversi tessuti in condizioni normali ed evidenziare eventuali variazioni di distribuzione (tessutale e all’interno del tessuto: stroma vs infiltrato) ed espressione di questa proteina in seguito all’esposizione all’asbesto e allo sviluppo di patologie asbesto correlate.
  • Obiettivo 2: L’individuazione e la caratterizzazione del ruolo funzionale della variante genetica dell’efestina, da noi recentemente associato alla protezione nei confronti del MPM, potrebbe inoltre permettere il concepimento di un nuovo approccio terapeutico di prevenzione negli individui ex-esposti, basato sull’impiego di chelanti del ferro e antiossidanti, come recentemente proposto da alcuni studi preclinici [Nagai et al, 2013; Toyokuni, 2011, 2014]. la popolazione degli ex-esposti all’amianto è particolarmente numerosa nella nostra regione (più di 7000 individui-aggiornare) e l’individuazione dei fattori di rischio individuali risulta particolarmente urgente in vista del raggiungimento del picco dell’incidenza di casi del mesotelioma maligno previsto nel 2025. Lo scarso successo terapeutico nei confronti di questa neoplasia fa infatti dell’identificazione dei fattori di rischio individuali e quindi della diagnosi precoce una pressante priorità.