Vie biologiche associate allo sviluppo di tossicità polmonari in pazienti con mesotelioma trattati con radioterapia emitoracica radicale: uno studio preliminare

Vie biologiche associate allo sviluppo di tossicità polmonari in pazienti con mesotelioma trattati con radioterapia emitoracica radicale: uno studio preliminare

Sergio Crovella1, Alberto Revelant 2, Elena Muraro 3, Ronald Rodrigues Moura 4, Lucas Brandão 4, Marco Trovò 5, Agostino Steffan 3, Paola Zacchi 6, Giuliano Zabucchi 6, Emilio Minatel 2 e Violetta Borelli 6*

• 1 Dipartimento di Scienze Biologiche e Ambientali, College of Arts and Sciences, University of Qatar, Doha, Qatar
• 2 Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (CRO) Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS), Aviano, Italia
• 3 Unità di Immunopatologia e Biomarcatori, Dipartimento di Ricerca Traslazionale, Centro di Riferimento Oncologico di Aviano (CRO) Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico, Aviano, Italia
• 4 Dipartimento di Diagnostica Avanzata, Istituto per la Salute Materno-Infantile – Istituti di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) “Burlo Garofolo”, Trieste, Italia
• 5 Dipartimento di Radioterapia Oncologica, Ospedale Accademico di Udine, Udine, Italia
• 6 Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Trieste, Trieste, Italia

La radioterapia emitoracica radicale (RHR), dopo la chirurgia lung-sparing, è diventata recentemente una concreta opzione terapeutica per il mesotelioma pleurico maligno (MPM), un tumore correlato all’amianto, altamente aggressivo con incidenza crescente e prognosi infausta. Sebbene la tossicità associata a questo trattamento sia stata ridotta, non è ancora trascurabile e deve essere considerata nel trattamento dei pazienti. I fattori genetici sembrano svolgere un ruolo nel determinare la tossicità della radioterapia. Lo scopo di questo studio è l’identificazione di percorsi biologici, recuperati attraverso il sequenziamento dell’intero esoma (WES), possibilmente associati allo sviluppo di effetti avversi polmonari nei pazienti MPM trattati con RHR. Lo studio ha incluso individui con MPM, trattati con chirurgia lung-sparing e chemioterapia, seguiti da RHR con intento curativo, e seguito prospetticamente per lo sviluppo di tossicità polmonare. A causa del forte impatto delle tossicità polmonari di grado 3 sulla qualità della vita, rispetto agli eventi avversi meno gravi, per le analisi genetiche, i pazienti sono stati divisi in un gruppo di tossicità polmonare assente o tollerabile (NoSTox) (grado ≤2) e un gruppo di tossicità polmonare grave gruppo di tossicità (STox) (grado = 3). L’analisi dell’arricchimento delle varianti ha permesso di identificare diverse firme di percorso che caratterizzano i pazienti NoSTox e Stox, consentendo di formulare ipotesi sulla protezione dagli effetti collaterali derivati dalla radioterapia nonché dai fattori che predispongono a una peggiore risposta al trattamento. I nostri risultati, consapevoli dell’esiguo numero di pazienti analizzati, potrebbero essere considerati un punto di partenza per la definizione di un panel di percorsi, eventualmente utili nella gestione dei pazienti MPM.

1. Introduzione
Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore correlato all’amianto, altamente aggressivo, derivato dalle cellule della pleura, con un’incidenza crescente (picco previsto nel periodo 2020-2024) ( 1 ) e prognosi infausta. Tale triste esito deriva anche dalla complessa gestione della malattia, dato che la comunità scientifica dibatte ancora sul miglior protocollo da seguire in base alle tre opzioni terapeutiche attualmente disponibili: chirurgia, radioterapia e chemioterapia ( 2 – 4 ).
Fino a poco tempo, si pensava che l’efficacia della somministrazione di routine della radioterapia nei pazienti con MPM non fosse supportata da prove ( 5 ). Negli ultimi anni, le moderne tecniche di radiazione sono state applicate dopo l’intervento chirurgico, consentendo un risparmio più efficace del tessuto normale, consentendo così dosi di radiazioni più elevate nel sito del tumore. Reasearchers dal National Cancer Institute di Aviano hanno pubblicato una serie di studi prospettici ( 6 – 8 ) che dimostra la radioterapia ad intensità modulata radicale, dopo l’intervento chirurgico al polmone-risparmiatori, porta ad un eccellente controllo loco-regionale e la sopravvivenza nei pazienti MPM. Una sopravvivenza globale (OS) mediana di 25,6 mesi e un tasso di OS a 2 anni del 58% sono tra i migliori risultati osservati in studi recenti ( 9 –11 ), sostenendo l’idea che questo approccio rappresenti una concreta opzione terapeutica per il MPM.
Sebbene la tossicità associata a questi trattamenti sia stata drasticamente ridotta, non è ancora trascurabile e deve essere presa in considerazione quando si trattano i pazienti ( 12 ). Le tossicità polmonari sono molto comuni tra i pazienti affetti da mesotelioma sottoposti a radioterapia sull’intero emitorace anche se il trattamento è ben tollerato.
Sebbene rari, si possono osservare effetti avversi peggiori, come la fibrosi di grado 2 o 3 e l’embolia polmonare, e la gestione di queste tossicità è ancora difficile.
Migliori modi di prevedere, prima del trattamento, il rischio di sviluppo di effetti polmonari avversi dopo la radioterapia possono portare a trattamenti personalizzati più promettenti e a una ridotta incidenza e gravità degli effetti tardivi. C’è un crescente riconoscimento che la causa della normale tossicità dei tessuti è multifattoriale e include fattori genetici oltre a parametri dosimetrici, età del paziente, storia di fumo, trattamenti concomitanti e comorbidità ( 13 – 15 ).
Nell’ultimo decennio sono stati pubblicati più di cento articoli che affrontano possibili associazioni tra varianti genetiche germinali e rischio di normale tossicità tissutale dopo radioterapia. Con poche eccezioni, tuttavia, questi si basavano su relativamente pochi studi che utilizzavano un approccio genetico candidato [analisi della variante a singolo nucleotide (SNV)] ( 16 ), e i risultati dell’associazione non sono stati replicati ( 17 , 18 ).
Recentemente, le analisi di associazione genome-wide (GWAS), inclusa la meta-analisi, eseguite dal Consorzio Radiogenomics (RgC; epi.grants.cancer.gov/radiogenomics/) hanno identificato diversi nuovi SNV all’interno di geni non precedentemente collegati alla tossicità della radioterapia, in pazienti affetti da diversi tipi di cancro, come seno, prostata e polmone ( 19 , 20). Tuttavia, la suscettibilità genetica alla radiotossicità negli individui non sindromici resta da chiarire. Con l’obiettivo di contribuire all’identificazione di un possibile ruolo delle variazioni genetiche nelle vie biologiche coinvolte nella risposta alla radioterapia nei pazienti con MPM, abbiamo eseguito il sequenziamento dell’intero esoma (WES), abbinato a un nuovo approccio bioinformatico, concentrandoci non solo sugli SNV ma soprattutto su potenziali vie biologiche associate alla tossicità polmonare dopo radioterapia che possono aiutare a chiarire meglio i fenotipi osservati.

2 metodi
2.1 Partecipanti allo studio
Lo studio ha incluso individui con MPM, trattati con trattamento chirurgico non radicale, come pleurectomia/decorticazione parziale (P/D) o solo biopsia e chemioterapia a base di platino più pemetrexed per MPM, seguita da radioterapia ad alte dosi con intento curativo e seguito prospetticamente per lo sviluppo di tossicità (polmonare). Altri criteri di inclusione erano età ≥18 anni, malattia residua evidente dopo l’intervento chirurgico, stadi I-IVA (secondo lo stadio TNM 7a edizione), punteggi dello stato di performance dell’Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) 0-2, funzione polmonare di almeno il 50% della prevista fattibilità tecnica per l’erogazione della radioterapia emitoracica radicale (RHR), funzione del midollo osseo soddisfacente (globuli bianchi ≥2.000/μl, piastrine ≥100.000/μl, emoglobina >10 g/dl). I criteri di esclusione erano linfonodi mediastinici controlaterali patologici (N3), MPM metastatico (stadio IVB) o malattia intra-scissurale. L’istologia del tumore è stata classificata come epitelioide e non epitelioide (sarcomatoide e bifasico). Tutti i pazienti sono stati stadiati mediante tomografia computerizzata (TC) con mezzo di contrasto polmonare e addominale e tomografia a emissione di positroni (PET)/TC con 18F-fluorodesossiglucosio (18FDG).
Tra agosto 2014 e maggio 2018, sono stati inclusi in questo studio 49 pazienti che hanno ricevuto RHR. I pazienti sono stati trattati con IMRT elicoidale, erogando la dose con Accuray Tomotherapy System. La tecnica di radioterapia è stata precedentemente descritta in dettaglio ( 7 , 8 , 11 ). I pazienti hanno ricevuto 50 Gy in 25 frazioni (tranne un caso, descritto in seguito), più un eventuale boost a 60 Gy sulle aree PET-positive.
La OS è stata definita come il tempo (anni) di rapporti dalla randomizzazione alla morte per qualsiasi causa, o l’ultimo follow-up (fino al 1 dicembre 2020), e stimato con il metodo Kaplan-Meier, il p- value è stato calcolato con Log-rank test.
Questo studio prospettico è stato condotto secondo i principi etici della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico locale ( Comitato Etico Indipendente del CRO di Aviano , CRO-2013-38) ed è stato ottenuto il consenso informato scritto da tutti i pazienti. Il servizio CRO-biobanking ha gestito e conservato tutti i campioni biologici prima dell’uso per il presente progetto (autorizzazione per le analisi ottenuta tramite protocollo numero 6825/D).

2.2 Valutazione della tossicità della radioterapia
La tossicità è stata valutata utilizzando i Common Terminology Criteria for Adverse Events versione 3.0 e suddivisa in tossicità precoce (durante il trattamento), tossicità acuta (1-6 mesi dalla fine della RHR) e tossicità tardiva (> 6 mesi dalla fine della RHR). ).
La tossicità precoce è stata valutata settimanalmente durante le radiazioni. Dopo il completamento del trattamento con radiazioni, i pazienti sono stati esaminati a 1, 3, 6 (tossicità acuta), 8 e 12 mesi nel primo anno (tossicità tardiva) e ogni 4 mesi dall’inizio del secondo anno o prima per necessità cliniche. Sono stati analizzati tutti gli esiti di tossicità respiratoria: tosse, dispnea, fibrosi, polmonite ed eventi tromboembolici polmonari.
2.3 Genotipizzazione, controllo qualità e imputazione/analisi statistica

2.3.1 Estrazione del DNA
Il DNA germinale del sangue intero (campioni di sangue raccolti in anticoagulante-citrato-destrosio prima dell’inizio del trattamento con radiazioni) è stato estratto da pazienti utilizzando il kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Milano, Italia) seguendo il protocollo del produttore. La qualità e la quantità del DNA sono state valutate mediante elettroforesi su gel di agarosio (2%) e utilizzando il test Invitrogen Qubit (Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia). Tutti i campioni ( N = 49) estratti hanno superato con successo il controllo di qualità, basato sui requisiti Macrogen ( https://dna.macrogen-europe.com/eng/ ) per il sequenziamento dell’esoma.

2.3.2 Sequenziamento dell’esoma
Il sequenziamento dell’esoma è stato eseguito in outsourcing utilizzando il servizio fornito da Macrogen Europe (Amsterdam, Paesi Bassi). In breve, l’analisi sequenziamento, che mira a 150 × di copertura, ha utilizzato l’Illumina ® preparazione e sequenziamento reazione SureSelect V7 umana Kit biblioteca, in un Illumina ® HiSeq 2500 sistema, generando coppia-end legge di 125 coppie di basi.
Gli adattatori universali Illumina sono stati rimossi utilizzando Trim Galore 0.6.1 ( http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ ). Anche le letture con lunghezza inferiore a 15 paia di basi e con punteggio Phred basso ( Q < 20) sono state rimosse utilizzando lo stesso software. Il controllo di qualità prima e dopo queste procedure è stato valutato da fastQC ( https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ ). Dopo il controllo qualità, il file FASTQ con le letture grezze è stato allineato utilizzando il pacchetto software Burrows-Wheeler Aligner ( 21 ), in particolare lo strumento bwa-mem, rispetto alla versione 38 del genoma umano di riferimento (GRCh.38). Abbiamo quindi utilizzato gli strumenti Picard ( https://broadinstitute.github.io/picard/ ) per contrassegnare i duplicati e GATK V. 4.1.2.0 ( https://software.broadinstitute.org/gatk/ ) per la ricalibrazione di base. Strelka2 è stato utilizzato per la determinazione delle varianti, quando il software è stato impiegato nella modalità di analisi dell'esoma ( 22 ). Infine, abbiamo usato di nuovo GATK per l'esclusione delle varianti di bassa qualità. L'annotazione delle varianti è stata eseguita utilizzando il software ANNOVAR ( 23 ) con database relativi al genoma di riferimento GRCh.38 (refGene, cytoBand, wgRna, 1000g_2015_aug_all, gnomad30_genome, dbscsnv11, dbnsfp35a, clinvar_20200316 e avsnp151). R Software ( 24 ) è stato impiegato per manipolare i risultati di ANNOVAR per un'analisi descrittiva e inferenziale. Abbiamo diviso l'analisi in due parti principali: individuale, che consiste nel riassumere i dati descrittivi per ogni campione sequenziato; e dati di gruppo, che mirano a confrontare i pazienti con tossicità grave rispetto a nessuna tossicità grave. L'analisi delle componenti principali (PCA) della distribuzione delle varianti è stata eseguita utilizzando i pacchetti stats R in un approccio non centrato e ridimensionata per avere una varianza unitaria prima dell'analisi ( 25 ). Inoltre, sia per le categorie individuali che di gruppo, abbiamo eseguito una "analisi di arricchimento variante" (VEA). VEA funziona in modo simile all'analisi dell'arricchimento genico per i dati di espressione: abbiamo studiato se c'erano differenze statistiche tra il numero di varianti in un percorso rispetto a un set di dati di riferimento. Abbiamo utilizzato il pacchetto R "ReactomePA" per ottenere informazioni sul percorso su ciascuno dei geni contenenti almeno una variante nel singolo set di dati ( 26 ). Quindi, abbiamo ottenuto i dati delle varianti da GnomAD Exome 3.0 ( 27 ) da utilizzare come set di dati di riferimento. È importante ricordare che, poiché la presenza di alcune varianti può essere correlata a popolazioni specifiche, abbiamo considerato per questo set di dati solo le informazioni sulle varianti europee non finlandesi (nfe). Una volta ottenuto il numero di varianti per percorso nel singolo set di dati e nel set di dati di riferimento, abbiamo utilizzato il test esatto di Fisher con tasso di falsa scoperta (FDR) per identificare le differenze statistiche nel numero di varianti. I valori di p aggiustati <0,05 sono stati considerati significativi in questa analisi. Per i dati di gruppo, abbiamo utilizzato i diagrammi di Venn per riassumere i percorsi "arricchiti" esclusivi per ciascun gruppo. 3. Risultati 3.1 Pazienti Le caratteristiche dei pazienti sono riassunte nella Tabella 1 . Un totale di 48 pazienti ha completato il trattamento come prescritto. Un paziente, che ha richiesto un'interruzione del trattamento a causa di anemia e trombocitopenia, ha ricevuto globalmente 32 Gy in 16 frazioni. Un paziente ha sviluppato una polmonite infettiva indipendentemente dalla RT e ha interrotto il trattamento, completando il corso prescritto in un secondo momento. Quarantacinque pazienti hanno ricevuto la spinta simultanea. TABELLA 1 Tabella 1 Pazienti e caratteristiche del tumore. Gli effetti avversi riportati sono riassunti nella Tabella 2 , suddivisi in eventi osservati durante il trattamento (tossicità precoce), tra 1 e 6 mesi dopo la fine della RT (tossicità acuta) e dopo 6 mesi di follow-up (tossicità tardiva), e classificati come tossicità non polmonare o polmonare. TAVOLO 2 Tabella 2 Eventi non polmonari e polmonari osservati come tossicità precoce, acuta e tardiva. A livello globale, per le tossicità acute e tardive, il numero di eventi nel gruppo della tossicità non polmonare tendeva a diminuire, ad eccezione dell'aumento della gamma-glutamiltransferasi (GGT) epatico, comunemente osservato nei pazienti trattati nell'emitorace destro (non mostrato). Fratture e versamenti pericardici sono tipicamente eventi tardivi e sono stati osservati in un piccolo numero di pazienti, rispettivamente 2 e 3 casi. Al contrario, gli eventi di tossicità polmonare tendevano a svilupparsi dopo il trattamento ea durare nel tempo. Un terzo dei pazienti ha sviluppato tosse di basso grado entro 6 mesi dalla RT o in un successivo follow-up. La dispnea è stata segnalata nel 37% dei pazienti come tossicità acuta, principalmente di basso grado, ma è diventata una tossicità grave nell'8% dei pazienti, come evento tardivo. La fibrosi si è sviluppata in 3 pazienti (2 gravi) e la polmonite in 7 casi, di cui 4 di grado 3. Infine, A causa dell'impatto delle tossicità polmonari di grado 3 sulla qualità della vita, per ulteriori analisi genetiche i pazienti sono stati divisi in due gruppi: nessuna tossicità severa (NoSTox), nessuna o tossicità tollerabile (grado da 0 a 2) (grado ≤2) ( N = 40) e graveTox (STox) (grado = 3) ( N = 9) in base allo sviluppo di almeno uno tra i seguenti: tosse, dispnea, fibrosi, polmonite e/o evento tromboembolico. Le caratteristiche dei pazienti con STox e gli effetti avversi riportati sono riassunti nella Tabella 3 . Durante il trattamento non sono state registrate tossicità di grado 4 o 5. TABELLA 3 Tabella 3 STox: caratteristiche del paziente, del tumore e delle tossicità polmonari. Tra i 49 pazienti inclusi, l'OS mediana era di 25 mesi e il tasso di OS a 2 anni era del 51,4%. Non sono state osservate differenze significative di sopravvivenza tra il gruppo NoSTox e il gruppo STox (dati non mostrati). 3.2 Analisi genetica mediante analisi di arricchimento delle varianti I risultati dell'analisi genetica globale e tutti i rapporti dettagliati sull'esoma sono mostrati nei Dati supplementari 1, 2 . I Dati Supplementari 1 contengono le informazioni descrittive sull'analisi esomica dei 49 pazienti con MPM; la distribuzione delle varianti ( Tabella supplementare S1A ), la distribuzione (%) della posizione della variante ( Figura supplementare S1A ), la funzione ( Figura supplementare S1B ) e la distribuzione dei geni portatori di varianti ( Tabella supplementare S1B ) sono riportate nel rapporto sull'esoma di entrambi i gruppi (STox e NoSTox). Dati supplementari 2contenere una descrizione comparativa sui geni e sulle varianti comuni di 49 pazienti con MPM; Le varianti comuni NoSTox e STox sono state filtrate per recuperare solo le varianti comuni FunctVar ( Tabella supplementare S2A ) e ImpactVar ( Tabella supplementare S2B ) esclusive del gruppo STox; allo stesso modo, le varianti comuni NoSTox e STox sono state filtrate per recuperare le varianti comuni FunctVar ( Supplementary Table S2C ) e ImpactVar ( Supplementary Table S2D ) presenti solo nel gruppo NoSTox. Degno di nota, nessuno dei geni segnalati da Hylebos e colleghi ( 28 ), per mostrare alterazioni molecolari in MPM, era correlato allo sviluppo di tossicità polmonare nei soggetti coinvolti in questo studio (dati non mostrati). Sulla base dei risultati ottenuti considerando le varianti presenti solo nei pazienti STox, abbiamo recuperato i percorsi eventualmente interrotti dalle varianti genetiche identificate, senza, tuttavia, rilevare una firma di percorso specifica associata ai fenotipi clinici osservati (dati non mostrati). Inoltre, con l'obiettivo di applicare un approccio più ampio per arricchire l'analisi del percorso, abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento variante basata su varianti funzionali e di impatto; 47 percorsi hanno mostrato un numero significativamente aumentato di varianti funzionali esclusivamente nel gruppo NoSTox ( Tabella 4 ). Per il gruppo STox, abbiamo osservato quattro vie esclusive ( Tabella 5 ). Per quanto riguarda le varianti di impatto, abbiamo osservato 19 e 3 percorsi esclusivi per i gruppi NoSTox e STox, rispettivamente ( Tabelle 6 , 7 ). TABELLA 4 Tabella 4 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale nel gruppo NoSTox. TABELLA 5 Tabella 5 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale nel gruppo STox. TABELLA 6 Tabella 6 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante di impatto nel gruppo NoSTox. TABELLA 7 Tabella 7 Elenco delle vie del reattore recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante di impatto nel gruppo STox. Tracciando le varianti eventualmente coinvolte in quei percorsi, abbiamo notato 243 varianti funzionali (lungo 64 geni), per il gruppo NoSTox e 9 varianti per STox (in 5 geni) ( Dati supplementari 3 : Tabella S3A, B ). Considerando i percorsi con varianti di impatto, abbiamo identificato 2.908 varianti (in 645 geni) presenti nei percorsi esclusivi del gruppo NoSTox, mentre è stata osservata solo una variante (un gene) nei percorsi del gruppo STox ( Dati Supplementari 3 : Tabelle S3C, D ). Nonostante le differenze genetiche e il numero di diverse varianti riscontrate tra NoSTox e STox, l'analisi delle componenti principali (PCA) ha mostrato una distribuzione omogenea delle varianti in entrambi i gruppi. Pertanto, non è stata osservata alcuna firma genetica specifica in NoSTox e STox ( Figura supplementare S3 ). Tuttavia, in tutte le analisi, il paziente 53 ha mostrato una distanza genetica significativa significativa rispetto a tutti gli altri pazienti indipendentemente dal fatto che fossero NoSTox o STox, suggerendo la presenza di una specifica firma genetica, ma non influenzando la risposta alla radioterapia. 3.2.1 Analisi dell'arricchimento della variante NoSTox L'analisi dell'arricchimento della variante ci ha permesso di identificare i percorsi nel gruppo NoSTox principalmente coinvolti in processi biologici comuni e non specifici come l'elaborazione dell'RNA, la segnalazione cellulare, il ciclo cellulare e la sintesi dei lipidi. All'interno delle vie individuate, quattro di esse, legate a processi infiammatori e fibrotici, eventualmente coinvolti nello sviluppo di tossicità polmonare, sono state riscontrate anche come in silico distrutte sulla base di varianti funzionali o di impatto non presentate (o rare) in GNOMAD 2.2.1 Non -Database della popolazione finlandese (contrassegnato in grigio nelle tabelle 4 , 6 ed elencato nella tabella 8 ). 1) La prima è la via di segnalazione NFkappaB indotta da TNFR1 (R-HSA-5357956). Una variante funzionale in questo percorso è stata trovata nel paziente n. 74: un inserimento frameshift nel gene dell'ubiquitina C (UBC) (ENTREZID: 7316; esone 2: c.2051dupG o p.V685Cfs*7; senza ID rs; situato su chr12 a 124911720 posizione) in eterozigosi. 2) La seconda è la via dell'inflammasoma AIM2 (R-HSA-844615). Una singola variante funzionale correlata a questa via è stata osservata nel paziente #16: una delezione frameshift nel gene Absent in melanoma 2 (AIM2) (ENTREZID: 9447; esone 5: c.712delA o p.T238Hfs*14; senza rs ID; situato su chr1 in posizione 159062697) ( Tabella 8 ). In particolare, questa via è stata trovata anche nell'elenco delle vie del reattore da impatto in un paziente diverso che non ha sviluppato gravi tossicità polmonari (#84, Tabella 6 ). In questo caso, il paziente #84 portava una variante sull'esone2 (c.C278G) di PYD e CARD Domain Containing (PYCARD) (ID ENTREZ: 29108; variante senza ID rs situata su chr 16 alla posizione 31202200). 3) La terza via identificata come compromessa nel gruppo NoSTox, è la via a cascata del segnale del recettore dell'insulina (R-HSA-74751). Tre varianti funzionali frameshift e una stopgain sono state trovate nei pazienti n. 21, n. 39, n. 43 e n. 16, rispettivamente ( Tabella 8 ). Tutte le varianti frameshift erano nel gene della proteina chinasi 3 attivata dal mitogeno (MAPK3) (ENTREZ ID: 5595). I pazienti #39 e #43 portavano la variante sull'esone1 c.37_38insC (senza ID rs, localizzato su chr16 in posizione 30123172). Il paziente n. 21 portava una variante dell'esone 1 c.38_39insC (senza ID rs; localizzato su chr16 in posizione 30123171). La variante di ripiego del paziente n. 16 era localizzata sull'esone 1 del gene della fosfodiesterasi 3B (PDE3B) (ENTREZ ID: 5140; esone 1 c.C447A; senza ID rs; localizzato chr11 in posizione 14644522). 4) L'ultima via che si prevede sia compromessa nel gruppo NoSTox è correlata alla biosintesi del plasmalogeno (R-HSA-75896), nei pazienti #50, #66 e #88 ( Tabella 8 ). Il gene gliceronefosfato O-Aciltransferasi (GNPAT) (ENTREZ ID: 8443) ha mostrato variazioni di impatto nei pazienti #50 e #66, rs11122266 e rs767514222, rispettivamente, entrambi nell'esone 9. Il paziente #88 portava l'SNP rs764286061 nell'alchilglicerone fosfato sintasi ( AGPS) (ENTREZ ID: 8540). TABELLA 8 Tabella 8 Elenco delle vie del reattore selezionate recuperate dall'analisi di arricchimento della variante (VEA) per la variante funzionale e di impatto nei gruppi NoSTox e STox: pazienti, geni e caratteristiche delle varianti coinvolte. 3.2.2 Analisi dell'arricchimento della variante STox Per quanto riguarda l'analisi dell'arricchimento della variante STox, due percorsi, identificati in silico , hanno raggiunto il potenziale per tradurre il fenotipo di tossicità grave (contrassegnati in grigio nelle tabelle 5 , 7 ed elencati nella tabella 8 ). 1) Dissoluzione della via del coagulo di fibrina (R-HSA-75205). Una singola variazione di ripiego sul gene F membro 2 della famiglia della serpina (SERPINF2) (rs374446894), è stata portata dal paziente n. 2, che ha sviluppato un evento tromboembolico polmonare ( Tabella 5 ). 2) Formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR (R-HSA-77042). Il paziente n. ad un alto grado di fibrosi ( Tabella 7 ). Questa variante partecipa anche all'editing dell'mRNA: conversione da A a I (R-HSA-75064) e vie di deaminazione C6 dell'adenosina (R-HSA-75102); tutti insieme, questi tre percorsi sono correlati all'editing dell'mRNA. Infine, abbiamo cercato nel nostro dataset sperimentale WES tutte le varianti genetiche, ottenute tramite GWAS, precedentemente identificate come associate alla tossicità della radioterapia; non sono state rilevate precedenti varianti genetiche associate ai fenotipi studiati nell'intero esoma di individui NoTox e STox ( Dati Supplementari 4 ). 4. Discussione L'impiego di RHR in MPM ha dimostrato di conferire un vantaggio in termini di sopravvivenza, ma è associato a un profilo di tossicità non trascurabile in una frazione di pazienti ( 8 , 11 ). Questo trattamento dovrebbe essere offerto alla maggior parte dei pazienti affetti da mesotelioma in quanto aumenta la sopravvivenza a 2 anni nei pazienti inoperabili al 58%, rispetto al tasso del 28% raggiunto da coloro che ricevono solo TC o radioterapia palliativa ( 11 ). Tuttavia, le tossicità associate al trattamento possono avere un impatto rilevante sulla qualità della vita. La tossicità polmonare può influenzare pesantemente la qualità della vita del paziente, causando principalmente tosse e dispnea che perdurano nel tempo. Nella dispnea di grado 1-2, c'è un peggioramento graduale come la dispnea da sforzo, mentre la tossicità di grado 3 ha un impatto anche sulle attività della vita quotidiana. Allo stesso modo, la polmonite di grado 1-2 è spesso paucisintomatica e influisce solo leggermente sulla qualità della vita, mentre la polmonite di grado 3 può avere un impatto permanente se evolve in fibrosi grave ( 29 ), come osservato in pochi casi nel presente studio. Gli eventi molecolari che portano alla tossicità/lesione tissutale indotta dalle radiazioni sono complessi e abbracciano una varietà di processi biologici, tra cui lo stress ossidativo, l'apoptosi, l'infiammazione e il rilascio di citochine proinfiammatorie e profibrogene ( 30 ). L'ambiente infiammatorio indotto dalla RT, aggravato da polmonite e successiva eventuale fibrosi, potrebbe indurre lo sviluppo di coaguli di fibrina, potenzialmente portando a un evento tromboembolico ( 31 ), una complicanza che si è verificata in 3 dei nostri pazienti, come effetto tossico acuto e tardivo. La causa della tossicità dei tessuti normali indotta dalle radiazioni è multifattoriale ( 13 – 15 ) e si è ipotizzato che fattori genetici svolgano un ruolo nel determinare la risposta alle radiazioni ( 32 ). Nonostante i progressi delle analisi genetiche basate sulle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, sebbene alcuni GWAS e il sequenziamento clinico di pazienti affetti da cancro abbiano suggerito che un certo numero di varianti nei geni di riparazione del DNA potrebbero essere alla base delle differenze individuali nella radiosensibilità cromosomica all'interno delle popolazioni umane ( 33 ), no Finora è stata proposta la traduzione nella pratica clinica. Quando si considerano gli studi GWAS, le varianti identificate non sono state replicate in diverse coorti di pazienti, essendo le poche varianti genetiche insufficienti per descrivere completamente un fenotipo complesso come la risposta alle radiazioni. I nostri risultati non fanno eccezione, essendo le varianti genetiche identificate tramite WES non specifiche dei due gruppi di pazienti analizzati (NoSTox e STox), non consentendo di conseguenza la stratificazione fenotipica dei pazienti. Inoltre, quando abbiamo cercato di trovare nel nostro dataset le varianti precedentemente descritte nel GWAS già pubblicato, non abbiamo osservato nessuna di esse, rafforzando ancora una volta il fatto che la semplice analisi delle varianti genetiche non può spiegare i fenotipi multifattoriali. Quindi, consapevoli che un fenotipo complesso non può essere sbrogliato semplicemente confrontando la distribuzione delle varianti genetiche in due gruppi, considerando anche il basso numero di pazienti analizzati che contribuiscono alla pressione statistica e al fallimento dell'associazione, abbiamo utilizzato un nuovo approccio computazionale volto a descrivere i percorsi specifici per ogni gruppo di pazienti. In tal modo, grazie all'analisi dell'arricchimento variabile, siamo stati in grado di identificare percorsi presenti solo nei gruppi NoSTox o STox; una firma di percorso è stata riconosciuta in NoSTox o STox. Sulla base della nostra analisi di arricchimento variabile, qui descriviamo i diversi percorsi associati agli esiti della radioterapia considerati (nessuna/tollerabile o tossicità polmonare grave), la cui rilevanza è supportata anche dalla letteratura. 4.1 Nessuno/Gruppo di tossicità tollerabile Quattro percorsi, correlati a processi infiammatori e fibrotici, possibilmente coinvolti nello sviluppo di tossicità polmonare, sono stati interrotti in silico nei pazienti noSTox. Altri percorsi interrotti erano correlati a processi biologici più generali non specificamente correlati ai fenotipi dei pazienti. I quattro percorsi sono i seguenti: 1. Via di segnalazione NFkappaB indotta da TNFR1 (R-HSA-5357956) Il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) è espresso rapidamente e in modo persistente nei tessuti irradiati e adiacenti ( 34 ). Può innescare più vie di segnale ( 35 ), inclusa l'attività di segnalazione di NFkB, che ha una forte azione/funzione proinfiammatoria e quindi deve essere strettamente controllata per prevenire l'infiammazione persistente. Un meccanismo che contribuisce a garantire un controllo adeguato di NFkB include l'ubiquitinazione ( 36 , 37 ). TNF-α è stato implicato in mucosite radiazioni, enterite, e dermatiti ( 30 , 38 - il 40 ), e la sua carenza in un modello di danno polmonare ha dimostrato di prevenire i sintomi di polmonite attinica ( 41 ). Una variazione funzionale si trova nella via di segnalazione NfkappaB indotta da TNFR1: un inserimento frameshift nel gene UBC. La proteina codificata da questo gene è un'ubiquitinasi (ubiquitina C). Sebbene i cambiamenti complessivi nei livelli cellulari di ubiquitina in risposta alle radiazioni ionizzanti siano ancora poco conosciuti, Tang e colleghi hanno dimostrato che la sottoregolazione dell'ubiquitina C riduce l'espressione di NF-kB indotta dalle radiazioni e ne inibisce la traslocazione nel nucleo ( 42 ), suggerendo che dopo l'irradiazione , il silenziamento della de-ubiquitinazione può sopprimere la risposta cellulare alle radiazioni indotta da NF-kB. 2. La via dell'inflammasoma AIM2 (R-HSA-844615) Una delezione frameshift nel gene AIM2 è stata rilevata nel paziente n. 16; inoltre, è stata osservata una variante su PYCARD nel paziente n. 84. AIM2 è un sensore immunitario innato che media l'assemblaggio e l'attivazione dell'inflammasoma in risposta alle rotture del DNA a doppio filamento ( 43 , 44 ). L'inflammasoma AIM2 sensibile al DNA controlla la morte cellulare indotta dalle radiazioni e il danno tissutale ( 45 ). In un modello di ratto di polmonite da radiazioni (RP), la radioterapia ha aumentato il livello di espressione di mRNA di AIM2, che ha ulteriormente innescato il rilascio di IL-1β e ha indotto RP ( 40), suggerendo che l'attivazione dell'inflammasoma AIM2 mediante radioterapia può contribuire alla patogenesi della RP. È interessante notare che la carenza di inflammasoma AIM2 ha dimostrato di proteggere i topi dalla sindrome dell'intestino tenue indotta dalle radiazioni e dall'insufficienza ematopoietica ( 45 ). Inoltre, il gene PYCARD (noto anche come ASC) codifica per una proteina adattatrice che media l'assemblaggio di grandi complessi di segnalazione che rappresentano un passaggio critico nell'iniziare le risposte dell'inflammasoma ( 46 ). 3. La via della cascata di segnalazione del recettore dell'insulina (R-HSA-74751) è stata interrotta in 4 pazienti NoSTox Esiste un alto grado di omologia strutturale tra il recettore dell'insulina (IR) e il recettore del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) (IGF-1R), che segnala tramite molti mediatori comuni ( 47 ). Le radiazioni ionizzanti attivano diversi recettori tirosin-chinasi coinvolti nella risposta al danno del DNA, incluso l'IGF-1R ( 48 ), probabilmente promuovendo uno stato profibrotico. Inoltre, la disregolazione dell'asse del fattore di crescita insulino-simile (IGF) è stata implicata nella patogenesi della fibrosi nelle malattie polmonari ( 49 – 52). Il fattore di crescita insulino-simile 2 (IGF-2) promuove la fibrosi attraverso IGF1R, IR e IGF1R/IR, differenzia i fibroblasti in miofibroblasti, riduce la produzione di proteasi e la degradazione della matrice extracellulare e stimola l'espressione di due fattori di crescita trasformanti β (TGF-β) isoforme, suggerendo che IGF-2 può esercitare effetti profibrotici attraverso molteplici meccanismi ( 53 ). 4. Biosintesi del plasmalogeno (R-HSA-75896) Prove recenti suggeriscono che i raft colesterolo-sfingolipidi potrebbero svolgere un ruolo nella segnalazione dell'insulina tramiteIR(54) Il potenziale contributo dei lipidi alla segnalazione dell'insulina è interessante poiché è stato dimostrato che la via di biosintesi del plasmalogeno ha anche un potenziale impatto sui fenotipi dei pazienti NoSTox, portati dai pazienti #50, #66 e #88 che non hanno sviluppato gravi tossicità polmonari. I plasmalogeni rappresentano una classe di fosfolipidi che si trovano ubiquitariamente in quantità considerevoli come costituenti delle membrane cellulari dei mammiferi e significativamente arricchiti nelle zattere lipidiche ( 55 , 56), microdomini funzionali nelle membrane cellulari, che possono influenzare la trasduzione del segnale. Pertanto, l'interruzione della biosintesi del plasmalogeno potrebbe influenzare la segnalazione transmembrana dell'insulina, creando così un ponte funzionale tra questa via e i meccanismi patogenetici della tossicità delle radiazioni. Inoltre, Laiakis e colleghi ( 57 ) hanno studiato gli effetti delle radiazioni ionizzanti sul livello ematico di metaboliti e lipidi, dimostrando che l'esposizione acuta alle radiazioni in un modello murino induceva una mobilizzazione specifica dei plasmalogeni. Sebbene il ruolo patologico dei plasmalogeni e le vie biochimiche alla base della loro sovraregolazione dopo l'esposizione alle radiazioni rimangano da chiarire, Braverman e Moser hanno suggerito una specifica biofirma lipidomica sierica come indicatore dell'esposizione alle radiazioni ( 58). Sulla base dei risultati dei percorsi nei soggetti NoSTox, abbiamo ipotizzato che il danno funzionale nel controllo dell'espressione indotta dalle radiazioni di NF-kB, principalmente nei/dei meccanismi di ubiquitinazione/deubiquitinazione, insieme a un danno del percorso dell'inflammasoma AIM2 e una disregolazione dell'asse del fattore di crescita insulino-simile (IGF) (possibilmente correlato a una biosintesi del plasmalogeno alterata), potrebbe modulare l'infiammazione polmonare indotta da radiazioni prevenendo lo sviluppo di polmonite acuta da radiazioni e fibrosi polmonare cronica indotta da radiazioni ( Figura 1 ). FIGURA 1 Figura 1 (A)L'analisi dell'arricchimento delle varianti eseguita su individui che hanno sviluppato tossicità polmonare indotta da radiazioni nulla/tollerabile suggerisce che il danno funzionale (frecce tratteggiate) nelle vie coinvolte nel controllo dell'espressione indotta da radiazioni di NF-kB (freccia tratteggiata verde = segnalazione NFkB indotta da TNFR1 pathway, variante funzionale correlata: 2/c.2051dupG) e attivazione dell'inflammasoma AIM2 (freccia tratteggiata gialla = l'inflammasoma AIM2, variante funzionale correlata: c.712delA, variante di impatto correlata: c.C278G), e del fattore di crescita insulino-simile (IGF) (freccia tratteggiata blu = cascata di segnalazione del recettore dell'insulina, varianti funzionali correlate: 1/c.38_39insC, 1/c.37_38insC, 1/c.37_38insC e 1/c.C447), possibilmente correlato a un plasmalogeno alterato biosintesi (attow punteggiato rosso = biosintesi del plasmalogeno, varianti di impatto correlate: 9/c.G1300A, 9/c.C1240T,e 1/c.A83T), potrebbe svolgere un ruolo nella prevenzione dello sviluppo di polmonite acuta da radiazioni e fibrosi polmonare cronica indotta da radiazioni.(B) L' analisi dell'arricchimento delle varianti eseguita su individui che hanno sviluppato una grave tossicità polmonare indotta da radiazioni suggerisce che, influenzando sia l'attività fibrinolitica (freccia bianca = dissoluzione del coagulo di fibrina, variante funzionale coinvolta: 4/c.C169T) sia le vie di modifica dell'RNA (luce freccia blu = formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR, variante di impatto coinvolta: 2/c.C577G), varianti specifiche in geni coinvolti in queste vie potrebbero essere responsabili dei gravi eventi di tossicità riportati da alcuni pazienti dopo l'irradiazione. 4.2 Gruppo di tossicità grave Lo stesso approccio basato sui percorsi interrotti dal rilevamento è stato utilizzato per il gruppo Stox. Sono stati trovati due percorsi interrotti, con potenziale impatto sui fenotipi dei pazienti Stox: 1. La dissoluzione della via del coagulo di fibrina (R-HSA-75205) È stata identificata una variante correlata a questo percorso: una variante di ripiego nel gene SERPINF2 nel paziente n. 2, che ha sviluppato un evento tromboembolico. L'irradiazione attiva l'attività procoagulante e riduce l'attività fibrinolitica ( 59 ) in modelli animali di irradiazione toracica, suggerendo il coinvolgimento della coagulazione e della fibrinolisi nel danno polmonare indotto dalle radiazioni ( 60 ). Il gene SERPINF2 codifica per un membro della famiglia degli inibitori della serina proteasi delle serpine, l'alfa 2 antiplasmina (α2-AP), che, insieme all'inibitore dell'attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1), è il principale inibitore diretto dell'attività fibrinolitica. L'alfa2-antiplasmina svolge un ruolo significativo nell'embolia polmonare acuta ( 61 ) ed è stato dimostrato che i pazienti con embolia polmonare mostrano un tasso più elevato di degradazione del coagulo di fibrina ( 62 )). La compromissione dell'attività dell'Alpha2-antiplasmina da parte della variante stopgain nel gene SERPINF2, eventualmente potenziando l'attività fibrinolitica, potrebbe quindi essere coinvolta nello sviluppo dell'evento tromboembolico polmonare osservato nel paziente 2#. 2. Formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR (R-HSA-77042) Una variante non sinonima ad alto impatto nel gene ADAR, coinvolta nella formazione di editosomi da parte delle proteine ADAR, è stata portata dal paziente n. 94, che è progredito verso la fibrosi di alto grado. La modifica post-trascrizionale dell'RNA è un processo chiave che controlla l'output del genoma e la deaminazione delle adenosine (A) in inosine (I) è l'evento principale di modifica dell'RNA negli esseri umani, catalizzato dall'adenosina deaminasi che agisce sulla famiglia dell'RNA (ADAR). di proteine ( 63 ). Gli effetti delle radiazioni sull'editing dell'RNA sono poco conosciuti; Liu e colleghi hanno riferito che dopo/dopo la radiazione di particelle α, i siti di editing dell'RNA cambiano notevolmente e la loro quantità totale diminuisce dopo la radiazione ( 64 ). È stato determinato che l'espressione di ADAR è tessuto specifica, essendo il polmone il secondo sito più altamente esprimente, in termini di espressione tissutale ( 65 , 66). L'analisi dell'editore dell'RNA (R-HSA-77042) della fibrosi polmonare idiopatica (IPF) e dei polmoni normali ha rivelato una maggiore frequenza di editing nell'IPF rispetto ai polmoni normali, suggerendo un ruolo per l'editing disregolato nella patogenesi dell'IPF ( 67 ). È stato scoperto che l'espressione di ADAR1 e ADAR2 è downregolata nei fibroblasti di pazienti con IPF ( 68 ). I cambiamenti nei livelli di espressione di ADAR1 e ADAR2 possono rappresentare un importante meccanismo di controllo nell'IPF, regolando l'elaborazione di miRNA chiave come il miRNA-21. La sovraespressione di miRNA-21 nel tessuto polmonare e nei fibroblasti polmonari di pazienti con IPF può essere dovuta a un editing difettoso da parte di ADAR ( 66). Questo miRNA mira alla sintesi proteica antifibrosante come il membro della famiglia SMAD 7, il recettore beta TGF 2 (TGF-βR2), l'inibitore della metallopeptidasi TIMP 3 (TIMP3) e il fattore di crescita endoteliale vascolare A (VEGF-A) ( 69 , 70 ). Il crosstalk tra i percorsi di impatto che controllano l'editing dell'RNA (R-HSA-75064 e R-HSA-77042) potrebbe contribuire all'induzione della grave fibrosi polmonare osservata nel paziente n. Presi insieme i risultati del percorso dei pazienti Stox, ci portano ad ipotizzare che specifiche varianti nei geni che influenzano sia l'attività fibrinolitica che le vie di editing dell'RNA, potrebbero essere responsabili dei gravi eventi di tossicità riportati, dopo irradiazione, da alcuni pazienti del gruppo Stox, che presentano queste varianti specifiche ( Figura 1 ). 5 Conclusione e prospettive future I nostri risultati WES non hanno mostrato alcuna variante genetica specifica associata ai fenotipi NoSTox e Stox, confermando così che l'approccio dello studio di associazione non è utile quando si considerano fenotipi complessi come la risposta alla radioterapia; tuttavia, i risultati ottenuti dall'analisi dell'arricchimento variante indicano diverse firme di percorsi che caratterizzano i pazienti NoSTox e Stox, consentendo di formulare ipotesi sulla protezione dagli effetti collaterali derivati dalla radioterapia nonché dai fattori che predispongono a una peggiore risposta al trattamento. Naturalmente, siamo consapevoli che il nostro studio soffre della limitazione legata al piccolo numero di pazienti analizzati, e della mancanza di dati trascrittomici, non disponibili a causa dell'impossibilità di raccogliere campioni biologici polmone/pleurici per il sequenziamento dell'RNA, per ricontrollare il nostro ipotesi. La possibilità di identificare i pazienti che, sulla base delle loro firme di percorsi, potrebbero rispondere meglio alla radioterapia rappresenta una futura applicazione traslazionale, una volta convalidate le firme su altri gruppi di pazienti. Consentendo l'identificazione precoce dei pazienti a rischio di tossicità polmonare dipendente dal trattamento, lo strumento predittivo basato sul percorso potrebbe svolgere un ruolo nella progettazione di nuove combinazioni terapeutiche, tra cui l'immunoterapia e la RT. Infatti, il trattamento di prima linea con nivolumab più ipilimumab è stato recentemente proposto nel MPM non resecabile, per migliorare l'OS rispetto alla chemioterapia. La potenziale sinergia di RT e immunoterapia, già osservata in altri tumori ( 71), potrebbe non solo migliorare ulteriormente la risposta clinica nella MPM, ma anche aumentare il rischio di effetti collaterali, condivisi da entrambi i trattamenti, come la polmonite ( 72 ). In questo contesto, la caratterizzazione genomica del pretrattamento potrebbe aiutare a prevenire lo sviluppo di gravi effetti collaterali contribuendo alla definizione di un trattamento personalizzato. Dichiarazione sulla disponibilità dei dati I set di dati presentati in questo studio possono essere trovati online nel repository SRA di PRJNA768626 id: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA768626 . Dichiarazione etica Questo studio prospettico, che coinvolge partecipanti umani, è stato rivisto e approvato dal Comitato Etico locale (Comitato Etico Indipendente del CRO di Aviano, CRO-2013-38). I pazienti hanno fornito il loro consenso informato scritto per partecipare a questo studio. Il servizio di biobanca CRO ha gestito e conservato tutti i campioni biologici prima dell'uso per il presente progetto (autorizzazione per le analisi ottenuta tramite protocollo numero 6825/D). Contributi dell'autore SC e VB hanno concepito l'idea originale e redatto il manoscritto. AR ha acquisito i dati e ha contribuito all'interpretazione dei risultati. RM e LB hanno eseguito l'analisi genetica e l'interpretazione dei dati. ElM e GZ hanno contribuito alla versione finale del manoscritto, hanno fornito feedback critici e hanno contribuito a dare forma alla ricerca. AS, MT, EmM e PZ hanno aiutato a supervisionare il progetto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale. Finanziamento Questo lavoro è stato finanziato dalla Lega Italiana per la Lotta contro i Tumori (LILT), ASSOCIAZIONE ISONTINA LILT (Bando di Ricerca sanitaria 2017-programma 5 per mille anno 2015) e dal Comune di Monfalcone (Gorizia). Conflitto d'interesse Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che possano essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi. Nota dell'editore Tutte le affermazioni espresse in questo articolo sono esclusivamente quelle degli autori e non rappresentano necessariamente quelle delle loro organizzazioni affiliate, o quelle dell'editore, degli editori e dei revisori. Qualsiasi prodotto che può essere valutato in questo articolo, o affermazione che può essere fatta dal suo produttore, non è garantito o approvato dall'editore. Ringraziamenti Siamo grati allo staff di CRO-biobank per il loro supporto nel reclutamento dei pazienti e nella gestione/preparazione dei campioni. Ringraziamo Alessandra Knowles per la revisione critica del manoscritto. Materiale supplementare Il materiale supplementare per questo articolo è disponibile online all'indirizzo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2021.784081/full#supplementary-material